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2018 年度 実績報告書

超高速・超解像1蛍光分子局在顕微鏡法による、接着斑の動的群島機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16H04775
研究機関京都大学

研究代表者

藤原 敬宏  京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード接着斑 / アクチン骨格 / 拡散運動 / 1分子計測 / 超解像
研究実績の概要

本研究は、「接着斑は、構成分子がダイナミックに拡散で出入りしている島を単位とし、それが多数集まることによって形成されている」という、「接着斑動的群島仮説」の正否の検証を目的とする。[1] 群島の生細胞超解像-構成分子の高速1蛍光分子同時観察、[2] 接着斑内のアクチン骨格構造の3次元超解像観察、[3] 群島構造の超解像定量、[4] 群島ダイナミクスの超解像マッピング、[5] 硬さの異なる基質に対する群島ダイナミクスの応答検出、の5段階の研究計画のうち、本年度は [3]、[4] を中心に推進し、以下の進捗があった。
(1) 接着斑構成分子パキシリンノックアウト MEF 細胞に、超解像蛍光タンパク質プローブ mEos3.2 を融合したパキシリンを安定発現させた。野生型 MEF における内在性のパキシリンと同程度、mEos3.2-パキシリンを発現したクローン株を得て、生細胞超解像観察をおこない、クラスター解析により群島構造の定量解析をおこなった。
(2) 新規の膜透過型 PALM 用蛍光色素 (PA-JF646) による接着斑近傍のアクチン骨格構造(ストレスファイバー終端、膜骨格の網目構造)標識方法を最適化し、接着斑マーカーである mEos3.2-パキシリンとの2色同時生細胞超解像観察をおこなった。
(3) mEos3.2-パキシリンをマーカーとして接着斑を観察しながら、インテグリン分子の3次元タイムラプス1分子追跡 (4 Hz/5分間) をおこなった。接着斑構成分子の接着斑近傍へのリクルート機構として、細胞膜上の拡散だけでなく、細胞内の方向性小胞輸送による濃縮が関与している可能性が示唆された。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 2件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Super-long single-molecule tracking reveals dynamic-anchorage-induced integrin function2018

    • 著者名/発表者名
      T.A. Tsunoyama, Y. Watanabe, J. Goto, K. Naito, R.S. Kasai, K.G.N. Suzuki, T.K. Fujiwara, and A. Kusumi
    • 雑誌名

      Nat. Chem. Biol.

      巻: 14 ページ: 497-506

    • DOI

      10.1038/s41589-018-0032-5

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Dynamic contact guidance of myoblasts by feature size and reversible switching of substrate topography: orchestration of cell shape, orientation and nematic ordering of actin cytoskeletons2018

    • 著者名/発表者名
      P. Linke, R. Suzuki, A. Yamamoto, M. Nakahata, M. Kengaku, T. Fujiwara, T. Ohzono, and M. Tanaka
    • 雑誌名

      Langmuir

      巻: 印刷中 ページ: 印刷中

    • DOI

      10.1021/acs.langmuir.8b02972

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] Actin-induced compartmentalization of the channels between the focal-adhesion-protein islands as revealed by simultaneous ultrafast PALM and single-molecule tracking2019

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Fujiwara
    • 学会等名
      16th International Membrane Research Forum
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Ultrafast single fluorescent-molecule imaging reveals hop diffusion within focal adhesion: actin-induced compartmentalization of the channels between the focal-adhesion-protein islands2018

    • 著者名/発表者名
      Takahiro Fujiwara
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Laboratory meeting on Single Biomolecules
    • 国際学会

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公開日: 2019-12-27  

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