| 研究課題/領域番号 |
16H04782
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
田口 友彦 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (10300881)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞増殖 / リサイクリングエンドソーム / YAP / ホスファチジルセリン / E3 リガーゼ |
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| 研究実績の概要 |
実施計画に従い、平成28年度は以下の３項目について実験を遂行した。
（1）リサイクリングエンドソーム（RE）に局在する新規蛋白質の同定：ビオチン化酵素BirA*を、申請者が作製したホスファチジルセリン（PS）選択的認識プローブ2xPH（evectin-2のPHドメインをタンデムにつなげることで、PSへの結合力を飛躍的に高めたもの。主にREにターゲティングする。）に融合させたコンストラクトを発現させることで、生きた細胞内でREのPS近傍蛋白質をビオチン化することに成功した。ビオチン化された蛋白質をアビジンビーズで回収し、次いで質量分析により網羅的に解析したところ、前年度までの解析結果とあわせて、約350種類の蛋白質を同定することができた。その中には、細胞増殖を正に制御する転写コアクチベーターYAPおよびYAPを負に制御するHippo経路の蛋白質が含まれていた。
（2）REに局在するユビキチンE3リガーゼによるYAP/Hippo経路の制御：PS依存的にREに局在するevectin-2の結合分子として、申請者はユビキチンE3リガーゼItch、WWP1、WWP2を同定している。これらE3リガーゼのノックダウンを行ったところ、細胞増殖の低下、YAPの不活性化体であるリン酸化YAPの量が増加、YAPのキナーゼであるLats1の量が増加すること、が明らかになった。よって、これらE3リガーゼがYAP/Hippo経路の制御に重要な働きをしていることが示唆された。
（3）ASPP1/ASPP2によるYAPの制御：YAPの脱リン酸化酵素と示唆されているASPP1/ASPP2をノックダウンしたが、細胞増殖に顕著な影響は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
PS近傍蛋白質を網羅的に質量分析で同定できたこと、さらに同定されてきた蛋白質の１つであるYAP転写コアクチベーターが、REに局在するNedd4 E3リガーゼーの制御を受けていることを明らかにすることができたことから、研究は順調に進展しているものと考える。さらに、Nedd4 E3リガーゼが、YAPの負の制御系であるHippo経路の中核分子であるLats1を分解していることまで突き止めることができたことから、当初の計画以上に研究は進展しているものと評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の成果として、全く予想していなかったREと細胞増殖との関連が示唆された。今後は、質量分析で同定されてきた蛋白質の中から、特にHippo/YAP経路を制御する可能性がある蛋白質に着目して、優先して解析を進めて行く。ASPP1/ASPP2のノックダウンにより細胞増殖に影響が認められなかったことは、protein phosphataseのリダンダンシーによる可能性が考えられるので、BirA*法によって同定したprotein phosphataseには特に着目して解析を行う。また、REのPS量に種々の方法により干渉した時に、細胞増殖に影響が出るかを評価することで、PSが細胞増殖に関与しているかどうかも明らかにする。
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