| 研究課題/領域番号 |
16H04816
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| 研究機関 | 首都大学東京 |
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研究代表者 |
坂井 貴臣 首都大学東京, 理工学研究科, 准教授 (50322730)
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| 研究分担者 |
武尾 里美 首都大学東京, 理工学研究科, 助教 (10642100)
上野 耕平 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 副参事研究員 (40332556)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | period / 長期記憶 / LNd |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではショウジョウバエの時計遺伝子period(per)に注目し，長期記憶形成に必須なper発現細胞の同定と，perの分子機能を解明することを目的として研究を行った。これまでの研究から，per発現細胞の中でもLNdと呼ばれる神経細胞群が長期記憶形成に関与することが示唆されていた。まず，LNd特異的に目的遺伝子を発現するための新たな遺伝子発現システム（mCherry-off GFP-onシステム）を確立するため，複数の形質転換系統を作製した。このシステムにより，LNdに目的遺伝子が発現していることをGFP蛍光により確認することができる。現在までに，LNdにPERを過剰発現するための形質転換系統を作製した。この系統を用いてLNdにおけるPER過剰発現が長期記憶にどのような影響を及ぼすか，今後検証する予定である。
PERタンパク質は複数のタンパク質との相互作用ドメインを持つ。長期記憶形成におけるPERタンパク質の分子機能を推定するため，PERタンパク質のどのドメインが長期記憶形成に必須であるのかを明らかにする実験を計画した。PERのタンパク質相互作用ドメインであるPASドメインを欠失させたトランスジーン（PERΔPAS）をLNdに強制発現させるための形質転換バエを作製した。今後は，これらの系統とｍCherry-off GFP-onシステムを組み合わせ，PERΔPAS強制発現により長期記憶形成においてドミナントネガティブ効果が得られるかどうかを検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの研究から，per発現細胞の中でもLNdと呼ばれる神経細胞群が長期記憶形成に関与することが示唆されていた。そこで，LNd特異的な遺伝子発現制御を目的とし，mCherry-off GFP-onシステムと名付けた遺伝子発現システムの確立に向けていくつかの形質転換系統を作製した。このシステムでは，組換え酵素FLPによるフリップアウト法と，２つの遺伝子発現システム（GAL4/UAS, LexA/LexAop）を組み合わせ，目的遺伝子が発現しない場合はLNdが赤色蛍光を発し，発現した場合は赤から緑の蛍光に変化する。これまでに，UAS-FRT>mCherry-STOP>FRT-GFP系統を作製してmCherry-off GFP-onシステムの有効性を検証した。全神経でGAL4を発現させた場合は神経系でmCheeryのみが発現し，hs-FLPを利用して熱ショックによりFLPを発現させた場合のみGFPが発現することを確認した。現在はGAL4とLexAの共発現がLNdのみで確認される系統のスクリーニングを行っている。
これまでに全身でperを過剰発現すると長期記憶が促進することが分かっている。よって，LNd特異的にperを過剰発現することにより長期記憶促進が予想される。現在までにmCherry-off GFP-onシステムによるLNd特異的なPER過剰発現実験を実現するための形質転換系統も作製した。今後，記憶測定に利用する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度には，mCherry-off GFP-onシステムに利用する形質転換系統の作製が一部完了し，FLPにより赤色蛍光から緑色蛍光へと変化することも確認できた。よって，今後はこれらの系統を利用して，LNd特異的な遺伝子発現を実現し，長期記憶形成への影響を検証する研究を進める。具体的には，LNd特異的なper過剰発現により，長期記憶促進が生じるかどうかを明らかにする。また，LNd特異的に神経活動を抑制した場合，長期記憶が形成されなくなるかどうかも明らかにする。
PERタンパク質は，タンパク質間相互作用として機能するPASドメインを持つ。長期記憶形成においてこのPASドメインが重要な役割を担っているかどうかを検証するため，LNd特異的にPERのPASドメインを欠失させたトランスジーンを強制発現し，ドミナントネガティブ効果が得られるかどうかを明らかにする。
PERは，概日リズムの光受容タンパク質であるCRYおよびリン酸化酵素であるDBTとPASドメイン以外のドメインを介して相互作用することが知られている。そこで，CRYやDBTが長期記憶形成に関与するかどうかを確認するため，RNA干渉法を利用し，LNdのCRYやDBTの発現を抑制した時の長期記憶を測定する。
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