| 研究課題/領域番号 |
16H04818
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
西山 敦哉 東京大学, 医科学研究所, 講師 (50378840)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNAメチル化 / ユビキチン / Dnmt1 / 質量分析 / DNA複製 / Uhrf1 |
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| 研究実績の概要 |
真核生物において、DNAメチル化はクロマチン構造の変換を介して、様々な生命現象に重要な役割を果たしている。染色体の複製時にはゲノムの本体であるDNAとともに、DNAメチル化パターンも娘DNAに正確に継承される必要があり、これはDNAメチル化酵素1(Dnmt1)を中心とする維持DNAメチル化機構によって保証されている。近年、DNA複製機構の詳細が解明され、精製蛋白質による再構成が可能となるに至った一方で、DNAメチル化継承の分子機構は未だ明らかでない。本研究では、DNAメチル化継承の過程を試験管内で再現可能であるツメガエル卵由来の無細胞系を用いて、新規DNAメチル化因子の探索と機能解析を行った。
まずDNA複製時のクロマチンを脱ユビキチン化酵素の存在下、非存在下の二種類の条件のもと単離し、ヌクレアーゼで切断することでクロマチン蛋白質を可溶化した後に、リコンビナントDnmt1でプルダウンを行うことで、クロマチン上でDnmt1と相互作用する因子の探索を質量分析を用いて行った。その結果、複数の蛋白質がユビキチンシグナル依存的にDnmt1と相互作用する因子として同定された。そこで、上記の因子について特異抗体を作製し、その機能解析を行ったところ、一つの因子がDNA複製およびUhrf1依存的にクロマチンに結合する活性を示すことが分かった。今後、この新規Dnmt1結合因子がDNAメチル化において果す役割についてさらに解析を進める。
また、本年は疾患を引き起こすDnmt1変異体の機能を詳細に解析するために昆虫細胞を用いた発現・精製系の確立を行った。上記の実験系を用いて得られたDnmt1蛋白質はDnmt1を免疫除去した抽出液に加えると、DNAメチル化を回復した。以上の結果から、機能的なDnmt1蛋白質の発現・精製系が確立できたと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年はDnmt1結合因子の探索を行った結果、Uhrf1の下流で働く新たな因子の同定に成功した。その因子に対する特異抗体も得られ、機能解析についてもこれまでの知見を活かして円滑に進めることができている。次年度以降に向けておおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に同定された新たなDNAメチル化制御因子について、試験管内染色体複製系および哺乳細胞を用いて機能解析を進め、そのDNAメチル化維持における役割を明らかにする。また、Dnmt1リコンビナント蛋白質を昆虫細胞を用いて発現・精製する系が確立したため、疾患に関わるDnmt1変異についても、該当する変異体について機能解析を進める予定である。
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