研究課題
A-1) RNAサイレンシング因子の内DCL2, DCL3, DCL4を欠損した3重変異体植物に感染できないBMV-M2系統から感染できるようになった変異体ウイルスを17株分離した結果、全てRNA3に変異が発見され、適応変異が作動するのは接種葉における細胞間移行過程であった。A-2)感染するF系統と非感染系統であるM1系統の間でゲノム交換変異体や遺伝子断片置換体等を作成し、植物体やプロトプラストにおけるゲノムRNAや各遺伝子産物の蓄積量調査を行った結果、RNA2内の2aタンパク質内の２アミノ酸置換が3重変異体植物における感染性に関わっていることが明らかとなった。A-3) 3重変異の中でBMVの感染系統の感染に寄与する遺伝子はDCL2とDCL4であった。また、DCL遺伝子の下流で機能する10種のAGO遺伝子の変異体植物におけるBMV感受性を調査した結果、少なくともAGO2が関わっていることが明らかとなった。B-1)これまでにコシヒカリとハバタキの間の染色体断片置換系統（CSSLs）の感染性を調べたところ第8染色体にBMVの感受性/抵抗性に関わる遺伝子が座乗している事が示唆されている。今年度は、そのコシヒカリとの戻し交雑系統群を利用し、この領域内での組み換え個体へのBMV感染試験から、候補遺伝子の領域を絞り込んだ結果、50 kbの領域にR遺伝子が発見されたのでそれぞれ感受性系統のイネに形質転換したところ、NBS2と名付けた優性の抵抗性遺伝子を同定することができた。B-2) BMVの2a遺伝子に終始コドンを導入することによって様々に2aタンパク質のC端を欠失した変異体を調製し、植物体、プロトプラストにおける感染性試験を行った結果、様々な植物種間で複製能においてC末端で重要な領域が異なっていた。また、移行能においても宿主が異なるとその変異体間の差が異なっていた。
2: おおむね順調に進展している
本研究では(1) BMV/シロイヌナズナ間の非宿主抵抗性と(2) BMV/イネ間の特異的抵抗性という２課題を扱っている。課題(1)については適応変異体の分離解析が順調に進み、変異体の特徴が明らかになった。すべてRNA3に変異が集中していたが、その変異は5’非翻訳領域、遺伝子間領域、外被タンパク質領域と様々であった。ところが、興味深いことにそれらの変異体のプロトプラストにおける増殖を調べた結果、全ての変異体に共通の特徴として3a移行タンパク質の高レベルの発現という予想外の結果が得られた。今後は、植物体から3a移行タンパク質を高発現させたり、別の植物における変異体の感染性を調べることで変異の生物学的意義を明らかにしていく。CPR5に関する試験は他のプロジェクトが順調に進んだだけ遅延したため、来年度に進めて行く必要がある。一方、イネのBMV抵抗性遺伝子については、品種抵抗性であることからR遺伝子の関与が考えられたが、これまでの知見から、接種葉における壊死斑などの観察に成功しておらず非R遺伝子の可能性も考え、単離を進めて来た。しかしながら、ファインマッピングの結果狭められた領域には２個のNB-LRR型の典型的なR遺伝子が発見された。この過程で、BMV抵抗性に関わる遺伝子は優性の抵抗性遺伝子であることが強く示唆されてきたので、候補遺伝子を感受性品種に形質転換で導入し抵抗性を付与できるかどうか調べた。導入品種としてはハバタキも考えられたが、インディカイネは形質転換が容易でないとの情報を得ていたので、当該遺伝子を含む領域のみ抵抗性品種の染色体領域に置換されたほぼジャポニカのゲノムを背景として持つ染色体置換系統の一つのラインを選び導入することとした。その結果、形質転換体が容易に獲得でき、また感受性試験の結果からも抵抗性遺伝子の同定に成功した。
課題(1) BMV/シロイヌナズナ間の非宿主抵抗性については変異体の分離解析は極めて順調に進んだ。一方、BMVへの非宿主抵抗性に関わるRNAサイレンシング以外の因子の探索については殆ど進捗しなかった。しかしながら初年度に、RNAサイレンシングに関わる3個のDCL遺伝子の内２つのDCL遺伝子に欠損を持つだけで非宿主抵抗性の一つの抵抗性障壁を乗り越えられることが判明したので、交配を利用して遺伝学的にRNAサイレンシング以外の障壁を探索する際にDCL３重変異体でなく２重変異体を交配親として利用できるため、探索作業がより容易になると考えられる。また、CPR5については、cpr5変異体で発現が常にオンである各種植物ホルモンのシグナル経路を遮断する変異を導入したcpr5変異体に関して、cpr5変異体と野生型植物との間で比較トランスクリプトーム解析を行うため、まず植物体の準備や栽培条件の検討等を行っていく。課題(2) BMV/イネ間の特異的抵抗性については、当初の計画よりも順調に進んでいる。今後は単離されたNB-LRR型のBMV抵抗性遺伝子NBS2を用いて抵抗性の実態解明と機構解明を進める。まずは、九州大学が整備しているTILLINGラインを用いてBMV抵抗性の崩壊したジャポニカイネ（日本晴）の感受性ラインの選抜を行い、NBS2タンパク質の構造機能解析を進める準備を始める。また、NBS2に相互作用するウイルス因子や宿主因子を同定するための準備としてHAやGFP等各種タグ配列をN端やC端に導入したNBS2遺伝子で再び感受性イネラインを形質転換し、末端へのタグの付加によるNBS2の抵抗性付与への影響に関する知見を得る。その後、Y2H、BiFC、共免疫沈降実験等を行うことによって相互作用因子の同定と機能解析を進めていく。
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すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件)
DNA Research
巻: 23 ページ: 535-546
10.1093/dnares/dsw037
