| 研究課題/領域番号 |
16H04887
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
奥田 充 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 中央農業研究センター, 上級研究員 (50355640)
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| 研究分担者 |
竹下 稔 宮崎大学, 農学部, 教授 (00304767)
増中 章 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 西日本農業研究センター, 主任研究員 (80466010)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / 経卵伝染 / 定量解析 |
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| 研究実績の概要 |
経卵伝染によりRSVを保毒するヒメトビウンカの発育段階において、RSVがどのように維持されているかを明らかにするため、リアルタイムPCRを用いてウイルスRNA量を解析した。試験には、2012年に茨城県の縞葉枯病発生水田で採取し、累代飼育しているRSV保毒ヒメトビウンカ個体群を供試した。まず、相対定量に適したリファレンス遺伝子を決定するため、羽化0、5、10、15日後の成虫よりそれぞれRNAを抽出し、数種ハウスキーピング遺伝子の発現を解析した結果、18SリボゾームRNA遺伝子(rRNA)が比較的安定して発現しており、相対定量のためのリファレンス遺伝子として適していることが示された。次に、同個体群の孵化2、9、13、16日後の幼虫及び羽化0、7、14、21日後の成虫からRNAを抽出し、RSVの外被タンパク質領域を増幅するプライマーを用いて、体内のウイルスRNAの相対定量を行った。その結果、幼虫体内の相対ウイルス量は、その発育期間中にほとんど変わらないことが示された。幼虫の発育に伴い、総RNA量は増加しているにもかかわらず相対量が一定であることから、RSVがヒメトビウンカの生育に同調して増殖していると推察された。一方、羽化後、雌成虫体内の相対ウイルス量はほとんど変わらないが、雄成虫体内の相対ウイルス量はわずかに増加する傾向が認められた。RSVの体内相対量は、雄が雌より1.4～2.5倍高い結果となった。また、RSVを経卵保毒するヒメトビウンカ個体群の雌成虫の個体ごとに次世代虫を飼育し、世代間の相対ウイルス量を比較したところ、世代間差は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
経卵伝搬されたRSVのヒメトビウンカ体内における増殖の解析については、予定どおり進捗した。異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析においては、解析に使用するイネ縞葉枯ウイルス検出薬のうち、平成28年8月以降に購入した試薬の活性が低下していることが判明し、実験を一時中断したが、試薬の製造元と原因を究明し、実験に支障がないことが明らかとなったため、平成29年3月に試験を再開した。抵抗性誘導剤を処理したイネにおけるRSV増殖及びRNAi型ウイルス抵抗性イネを用いた試験については、試験条件を検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
異なる宿主上で発育したヒメトビウンカ体内における増殖と経卵伝搬率の解析を行う。また、成虫のRSV獲得時期が経卵伝搬に与える影響の解析のため、羽化直後の無保毒ヒメトビウンカ成虫をRSVに感染したイネ幼苗に移し、一定期間後に体内のRSV濃度をリアルタイムPCRにより計測する。幼虫時期の獲得についても同様の試験を行う。
RNAi型ウイルス抵抗性イネによる昆虫体内RNAiの誘導の試験を行うためには、多量の種子が必要となるため、本遺伝子組換えイネの種子の増殖を行う。遺伝子組換えDNA実験を行う場合は、関連する法令を遵守して行う。また、実験は所内の遺伝子組換え安全委員会へ申請し、承認を得た上で行う。
抵抗性誘導剤によるイネにおけるRSV増殖への影響については、アシベンゾラルSメチル(ASM)を処理したイネにおける誘導抵抗性関連遺伝子の発現を解析する。また、ASM等を処理したイネにRSVを保毒したヒメトビウンカを放飼し、RSVの感染率と植物体におけるRSV増殖への影響をリアルタイムPCRにより解析する。
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