| 研究課題/領域番号 |
16H04894
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
五味 勝也 東北大学, 農学研究科, 教授 (60302197)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 遺伝子発現制御 / 糸状菌 / アミラーゼ生産 / 転写因子 / シグナル伝達 / 固体培養 |
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| 研究実績の概要 |
C2H2型転写因子FlbCは、glaBのみならず固体培養で発現が大幅に上昇するプロテアーゼ遺伝子pepA、nptA、nptBや酸性カルボキシペプチダーゼocpA、cpIの発現にも関与していることを明らかにした。glaBはプレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件により誘導されることが知られているが、flbCの発現に関わらずglaBは両条件が揃わないと発現量が上昇しなかった。麹菌のMAPK遺伝子5種類それぞれの破壊株を用いて、メンブレンを敷いたプレート培養上でGlaBの生産を調べた結果、50 mMのCaCl2を含む最小培地においてGlaBは野生株では生産されず、ΔhogAとΔmpkC株において生産が認められた。同様の条件でmpkCとflbCの二重破壊株ではGlaBの生産が大幅に減少した。このことから、MpkCがFlbCを負に制御することによりglaBの発現を制御していることが示唆された。
黒麹菌においてamyR、creAを欠失させた株をデンプンプレート培地で生育させたところ、ΔamyR株において著しい生育の悪化が見られたものの、野生株と同等のハローが見られたことから、ΔamyR株においてもアミラーゼが生産されていることが示唆された。小麦ふすまを基質とした固体培養ではΔamyR株は著しい活性の低下は見られなかった。ΔamyR株の酵素液を低pH処理すると酵素活性がほぼ見られなくなった。ΔamyR株においてamyAの発現は野生株とほとんど大差なかった一方でasaAの発現は見られなくなった。ΔcreA株では野生株と比較しamyAの発現は同程度であったのに対しasaAの発現は上昇する結果となった。以上の結果より、asaAは黄麹菌と同様の制御機構で制御されているのに対し、amyAはAmyRとは異なる転写因子によって制御されていることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
FlbCが制御する有用分泌酵素遺伝子として、glaB以外にも固体培養で発現が大幅に上昇する酸性・中性プロテアーゼ遺伝子や酸性カルボキシペプチダーゼ遺伝子の発現に関与していることを明らかにすることができた。また、プレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件が揃わないと発現量が上昇しないことも明らかとなった。さらに、麹菌の5種類のMAPキナーゼのうちMpkCがFlbCを負に制御することによりglaBの発現を制御していることを示唆する結果が得られたことは成果として評価できると考えている。
一方、黒麹菌におけるamyRおよびcreA破壊株を用いた研究から、黒麹菌の生産する耐酸性α-アミラーゼ遺伝子はAmyRとCreAの制御を受けるものの、非耐酸性α-アミラーゼ遺伝子はそれらの制御下になく、AmyRとは異なる未知の転写因子によって制御されていることが示唆される結果が得られたことも評価できると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）AmyR活性化基質のイソマルトースの細胞内輸送に関わるイソマルトーストランスポーターとイソマルトースのセンシングに関わるイソマルトースセンサーをゲノム情報と変異株スクリーニングから特定し、遺伝子破壊やアミノ酸置換変異などによりその機能を明らかにする。 2）細胞内および細胞外α-グルコシダーゼのイソマルトース変換に及ぼす寄与について解析することにより、AmyR活性化への関与を明らかにする。 3）転写因子FlbCが結合するシスエレメントをゲルシフトアッセイとChIP解析などにより同定するとともに、AmyRとの相互作用を調べ ることで協調的な発現制御機構を明らかにする。 4）黒麹菌においてAmyRとFlbCの遺伝子破壊株を用いて、アミラーゼ生産への影響を解析するとともに、AmyRの活性化とFlbCの機能を調べることにより、麹菌とA. nidulansのアミラーゼ生産制御機構との相違の有無を明らかにする。
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