| 研究課題/領域番号 |
16H04895
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
中村 顕 筑波大学, 生命環境系, 教授 (10207863)
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| 研究分担者 |
吉田 健一 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20230732)
矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 枯草菌 / L-glucose / inositol / 醗酵生産 |
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| 研究実績の概要 |
1. 枯草菌宿主の改良 前年度作製した、iolT及びiolG以外のinositol代謝酵素遺伝子を破壊した株に、さらに強力プロモーターPrpsOの制御下でiolGを発現するconstructをamyE領域に導入した株を作製した。この株はmyo-inositolを効率的にinososeへと変換することが可能であり、この株を今後のL-glucose生産の宿主とすることとした。
2. L-gluconate醗酵生産系の確立 昨年度の結果から、特にAhyiolN, lgnH(Bs)遺伝子の発現量が極めて低いことが明らかになったので、より強力なプロモーターを用いた発現系の構築が必要になった。そこで、pHT255のPgrac100プロモーターを枯草菌由来のPrpsOと置換することを試みたが、今までのところ成功していない。なお、pHT255-DniiolM及びpHT255-lgnHを導入した枯草菌抽出液中に、それぞれの酵素活性を検出することに成功し、少なくともこれら2つの酵素は活性を保持した形で枯草菌内で生産されることが明らかになった。
これと並行して、pHT255-DniiolMを昨年度作製した枯草菌宿主に導入し、培地にmyo-inositolを添加して培養したところ、少量ながらdiketo-inositolが生産されることを確認した。このことから、培地中のmyo-inositolがinososeを経由してdiketo-inositolへと変換されることが明らかになった。
3. 酵素改変によるL-gluconate reductaseの創製 昨年度の結晶構造解析の結果を踏まえて、LgdAとL-glucono-lactoneとの結合部位を同定した。その結果、R178を変異導入の候補とした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初は、L-gluconateへの変換に必要なDniiolM, AhyiolN及びlgnH遺伝子を同時に枯草菌宿主に導入し、myo-inositolからL-gluconateへの変換が可能かどうかまで検討する予定であったが、より高発現を図るためのプロモーターの検討を行うことを優先したため、この点についての検討を行うことができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
全体の研究計画には変更はないが、できるだけ速やかにプロモーターの検討を行い、3種の遺伝子を導入した枯草菌の作成を目指す。
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