| 研究課題/領域番号 |
16H04899
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
廣田 隆一 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (90452614)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 亜リン酸 / 還元型リン化合物 / PepM / ホスホン酸 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は還元型リン化合物の酸化経路の解析を中心に研究を進めた。次亜リン酸および亜リン酸を唯一のリン源とするMOPS－グルコース合成培地（MOPS-Pt培地）を用いて、数種類の園芸・農地圃場、湖沼底泥の土壌を用いて作製した希釈液の集積培養を行った。また、別途、複数のマメ科植物から採取した根粒に由来する根粒菌を酵母エキス－マンニトール培地で単離した。これら集積培養系および単離菌に対して、MOPS-Ptプレートで生育する細菌のスクリーニングを行った結果、土壌集積系から10株、根粒菌から8株の亜リン酸資化性菌を得た。これらの株の亜リン酸培地における増殖、16s rDNA配列に基づいた系統解析、および亜リン酸資化機構の解析を行った。土壌集積系から得られたSerratia sp., Herbaspirillum sp.の２株については亜リン酸をリン源とした場合の増殖がリン酸とほぼ同等であった。また、この２株の粗抽出液からは、他の8株には観察されない亜リン酸依存的なNADの還元活性が検出され、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（PtxD）による亜リン酸酸化経路を有している可能性が示唆された。一方、亜リン酸資化性根粒菌8株については、亜リン酸における増殖はリン酸使用時の約10-20％程度であり、PtxD活性が検出されず、C-Pリアーゼによる亜リン酸資化経路を有している可能性が示唆された。
リン酸還元経路の探索については、ホスホエノールピルビン酸ムターゼ（PepM）を対象とした縮重PCRによって得た8株の候補菌株について解析を行った。候補株をISP4合成培地で培養し、培養上清中の濃縮液を31P-NMRにより解析した。しかしながら、いずれのサンプルにおいてもホスホン酸に特有なシグナルが検出されず、検出限界値以下あるいは生成が行われていないと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
還元型リン化合物の酸化経路解析については、従来報告が無いバクテリアにおいてPtxD活性が検出されるなど新しい知見が得られており、研究計画通り進展している。リン酸還元経路については、得られた候補株におけるリン酸還元活性が検出されなかったため、解析条件の検討あるいは再スクリーニングが必要であると考えており、計画されている次年度の研究と共に実施する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、還元型リン化合物の酸化経路については、得られた株の亜リン酸以外の還元型リン（次亜リン酸、ホスホン酸類）について資化性を調べる。また、非常に強い亜リン酸酸化活性を示す単離株２株について、PtxD遺伝子の同定を行うと共に、PtxDの酵素学的特性を解析する。さらにこれら単離株については、基質となる亜リン酸、次亜リン酸の負荷量と増殖速度との関係についても解析を行い、生理学的特性に関する解析を進める。リン酸還元経路の探索に関しては、候補8株に関して培養条件を変更してホスホン酸合成の検出を継続する。同時に、縮重プライマーのターゲット領域を変更し、放線菌ライブラリに対して再度スクリーニングを実施し、新たな候補株を得る。また、嫌気条件下において直接的リン酸還元を行うバクテリアのスクリーニング系を構築する。
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