| 研究課題/領域番号 |
16H04921
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松田 幹 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20144131)
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| 研究分担者 |
大島 健司 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (90391888)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | カゼイン / 腸上皮細胞 / 細胞内消化 |
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| 研究実績の概要 |
食物アレルギーにおいて、吸収されたペプチド断片が減／脱感作を誘導してアレルゲン摂取に耐性を獲得する場合がある。反面、感作を増強して一層過敏な体質になるリスクもある。このような二面性を持つアレルゲンペプチド断片の腸管吸収と免疫調節の機構解明を目指す。腸上皮細胞の細胞内消化により生成し基底側に放出される（体内に吸収される）アレルゲンペプチド断片を生化学的に同定し、その中からT細胞エピトープを含むペプチド断片を選抜して免疫調節作用を明らかにする。今年度の研究により、多孔性膜上で培養、分化させたヒト腸上皮細胞株Caco-2が細胞内消化して基底側に排出するカゼイン成分のトリプシン分解断片の同定、定量に成功した。具体的には、回収した培地を、限外ろ過分離膜により分画し、分子量の大きい画分についてはTCA沈殿法によりペプチド断片を濃縮して、トリプシン、キモトリプシン等による酵素分解によりさらに低分子ペプチドとし、常法によりnanoLC-MALDI MS/MS分析およびMascot検索（Matrix Science）、ProteinPilot検索（AB SCIEX）により同定した。また、低分子量のペプチド断片についても、培地からODSカラム／チップを用いて回収し、プロテアーゼ処理をしないで直接LC-MS/MS分析に供し、カゼイン添加の有無によるMSスペクトルを比較解析し、カゼインペプチドと推定される複数のピークを確認した。さらに定量的質量分析法を用いて、各カゼイン成分由来のペプチド断片の定量に成功し、細胞内消化で生成する優勢なペプチドの解析への展開が可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
多孔性膜上で培養、分化させたヒト腸上皮細胞株Caco-2が細胞内消化して基底側に排出するカゼイン成分のトリプシン分解断片の質量分析による同定、定量に成功した。それらの多くは抗原エピトープを含むに足る大きさのペプチドであり、今後のエピトープ解析での成果が期待できる。このエピトープ解析は計画よりやや遅れているが、細胞内消化により生成し放出されるカゼインペプチドの定量的解析が可能となったことは、想定以上の進展であり、総合的に、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度の研究により、定量的質量分析法により放出されたカゼイン分解ペプチドを同定し定量する分析系を確立できたため、今後も、ペプチドの同定と定量を中心にして先に進める。優勢に生成し放出されるカゼイン分解ペプチドや他の食物タンパク質分解ペプチドの同定と定量を中心に研究を進め、その後、同定された優勢なペプチドに的を絞って抗原エピトープ解析を進める。
１．腸上皮細胞により消化・排出されたカゼイン由来短鎖ペプチド断片の同定
カゼインの細胞内消化断片の中で、比較的鎖長が長く、トリプシン分解により両端にArg/Lysが生成したペプチド断片の同定には成功したが、短鎖ペプチドなどでArg/Lysを含まない断片については同定が困難であった。そこで、生成した短鎖ペプチドのアミノ末端を化学修飾することでTagを付加し、質量分析において修飾基の質量に相当する娘イオンを生じる前駆イオンを探索する解析法（プリカーサースキャン法）を用いて、細胞基底側培地中に含まれるペプチド断片の網羅的解析を進める。
２．鶏卵アレルギーにおけるアレルゲンの細胞内消化断片の同定
昨年度のカゼイン成分に関する研究により確立した手法により、卵アルブミンおよびオボムコイドを抗原として用いて腸上皮細胞から基底側に排出されるペプチド断片をLC-MS/MS解析により同定、定量する。さらに、短鎖ペプチドに適したプリカーサースキャン法によるカゼインペプチドの同定に成功したら、同様の方法で、卵アルブミンとオボムコイド由来の短鎖ペプチドの同定と定量も進める。
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