| 研究課題/領域番号 |
16H04952
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
今井 貴規 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (20252281)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | norlignan / heartwood / Cryptomeria japonica / agatharesinol / sequirin C / oligomer |
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| 研究実績の概要 |
(1) 29年度、本科研費により導入された分取高速液体クロマトグラフ装置の使用により、化合物分離の効率が極めて改善された。すなわち、スギ心材から6種類のノルリグナン二量体が単離された。現在もこれらの構造解析を進めつつある。そのうち5種類の二量体については仮の化学構造の提出まで到達している。加えて、数種類の3量体の単離を進めている。
(2) ノルリグナン単量体(アガサレジノール)を炭水化物(グルコース)の存在下にてモデル的に酵素重合させた(市販ペルオキシダーゼによる)。生成物について、親和ゲルクロマトグラフィーにより残留炭水化物を除去した(ノルリグナン炭水化物結合体の調製)のち、TOCSY(Total correlation spectroscopy)-水素核磁気共鳴スペクトルによる選択的ピーク検出を試みた。その結果、僅かではあるがグルコース由来の水素NMRピークが抽出・確認され、したがって「結合体」の形成が示唆された。
(3) スギ材粗酵素液中のフェノール酸化酵素の検出手順において、非酵素的な酸化も同時に起こっていることが判明した。本問題に対応するため、酵素反応時間・pH等、様々な条件を再度検討した。その結果、酵素抽出・酵素アッセイにおいて、緩衝液のpHを6.5程度(これまでは7.5)とすることにより、問題を解決できることが分かった。
(4) スギ組織切片中のフェノール酸化酵素の活性染色の手順が確立された。まず、市販の活性検出キット(基質：ジアミノベンジジン)を用いた場合、活性は特定の細胞(放射柔細胞)に検出された。基質をスギ心材成分であるノルリグナンに代替した場合、放射柔細胞中に褐色の沈殿物が観察され、この沈殿の性状はノルリグナン標品を試験管内で酵素重合させた際に得られるものと酷似した。したがって、心材形成におけるノルリグナン生合成後の挙動(二次変化：放射柔細胞内での酵素重合・堆積)が組織化学的に示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1) 新規導入された分取高速液体クロマトグラフ装置の使用により、化合物分離の効率が極めて改善された。スギ心材から6種類のノルリグナン二量体が単離され、構造解析を進めつつある。そのうち5種類の二量体については仮の化学構造の提出まで到達している。これは、当初の予定どおりである。
(2) ノルリグナン単量体(アガサレジノール)を炭水化物(グルコース)の存在下にてモデル的に酵素重合させた。生成物について、親和ゲルクロマトグラフィーにより残留炭水化物を除去したもの(ノルリグナン炭水化物結合体)のTOCSY-NMRにより、僅かではあるが「結合体」の形成を示唆することができた。TOCSY-NMRによる検出は当初の想定より困難であった。
(3) スギ材粗酵素液中のフェノール酸化酵素の検出手順において、非酵素的な酸化も同時に起こることが判明した。本件について、酵素抽出・酵素アッセイにおいて緩衝液のpHを6.5程度(これまでは7.5)とすることにより、問題を解決できることが分かった。
(4) スギ組織切片中のフェノール酸化酵素の活性染色の手順を確立することができた。これにより、心材形成におけるノルリグナン生合成後の挙動(二次変化：放射柔細胞内での酵素重合)を組織化学的に示すことができた。これは当初の予定を上回る成果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 心材から単離された6種類のノルリグナン二量体の化学構造を確定する。加えて、ノルリグナン三量体の単離・構造決定に取り組む。
(2) ノルリグナン－グルコース結合体について、その結合頻度を上げるために重合手順の改良を試みる。先ず、アガサレジノールの仕込み方として “ゆっくり” 滴下する(これまでは所定量を “一度” に仕込み)。このようにしてアガサレジノール同志の結合の抑制・アガサレジノールと炭水化物とのより優位な結合を期待する。また、より天然に近い条件として、スギ材から分離されたヘミセルロース(炭水化物)存在下にてアガサレジノールの重合をみる。
(3) スギ材粗酵素液中のフェノール酸化酵素の検出において、非酵素的な酸化の可能性を排除するため、pHに留意した改良酵素抽出・酵素アッセイ手順によって、スギ材フェノール酸化酵素活性検出に再度取り組む。ノルリグナン単量体(アガサレジノールおよびセクイリンC)を基質とした酵素反応物をLCMS分析する。解析事項としてについて例えば、(a)どのような単量体組み合わせの二・三量体が生成するか、(b)どのような二・三量体が主・副物質となるか、(c)市販入手可能なフェノール酸化酵素(例えば西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ)による反応生成物との量的・質的比較によるスギ心材フェノール酸化酵素の特徴づけ、などに注目する。
(4) 昨年度に確立されたスギ組織切片中のフェノール酸化酵素の活性染色の手順を再検証するとともに、本酵素が検出されるスギ材部位(辺材、移行材、心材)や組織細胞(仮道管、放射組織)の詳細な検討ならびに組織内酵素反応物について化学的な情報の取得を試みる(蛍光顕微鏡・共焦点レーザー顕微鏡観察による)。
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