| 研究課題/領域番号 |
16H04955
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
一瀬 博文 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00432948)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | バイオテクノロジー / 微生物 / 担子菌 / トリテルペノイド / シトクロムP450 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、担子菌シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）の多彩な機能を組み合わせて有用トリテルペノイドの戦略的合成を可能にする。本年度は、真菌型トリテルペノイドの骨格化合物であるラノステロールに活性を示す P450 酵素の発掘を目指し、研究代表者が保有するP450異種発現酵母の代謝物分析を実施した。ラノステロールは宿主酵母の細胞内で恒常的に発現しており、異種発現させたP450により変換を受けた新規化合物が細胞内に蓄積すると考えられる。
ラノスタン型トリテルペノイドを標的とすることから、酵母内在性化合物のラノステロールおよびエルゴステロールを標的とした抽出条件を検討した。諸条件を最適化した後、P450異種発現酵母の代謝物を抽出してGC-MS分析に供して標的化合物の蓄積を追跡した。本年度は、白色腐朽担子菌Phanerochaete chrysosporiumに由来する120種類のP450を対象として解析を行った。一連の研究において、ラノステロール水酸化体の蓄積は確認されていないものの、エルゴステロールが変換を受けて蓄積したと推察される化合物が見出された。次年度以降は、褐色腐朽菌Postia placentaに由来する184種類のP450を対象とした解析を加えるとともに、エルゴスタン型化合物を蓄積させたP. chrysosporium P450の酵素機能について詳細な検討を加える。
また、植物型トリテルペノイドの骨格化合物に担子菌P450を作用させて新奇な化合物を創出することを目標としている。本年度は、ベツリン酸の高効率生産に向けて、当該化合物の骨格を生産可能なルペオール合成酵素の獲得を試みた。現在、ルペオール合成酵素と担子菌P450の共発現技術の開発を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、様々な担子菌シトクロムP450モノオキシゲナーゼをトリテルペノイド骨格に作用させて新奇な化合物を創出することを目標としている。本年度までに、標的化合物の分析条件を確立させており次年度以降の実験効率が大幅に向上すると期待される。また、ラノスタン型トリテルペノイドと骨格が類似するエルゴスタン型化合物を与えるP450も見出されており、当該P450と配列相同性を示す分子種に狙いを定めて詳細な解析を加えることも可能になりつつある。次年度以降は、担子菌ならびに麹菌のP450を用いた検討を加える予定であり、研究期間内に一次スクリーニングを終了できると期待している。
また、植物型トリテルペノイドの骨格化合物であるルペオールを合成可能な酵素の異種発現にも着手しており、次年度より担子菌P450を用いた植物型トリテルペノイドの生産について速やかに検討を開始する準備が整っている。
以上より、本研究は概ね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度までに、白色腐朽担子菌P. chrysosporiumに由来する120種類のP450を対象として解析を完了している。次年度以降は、褐色腐朽担子菌P. placenta および麹菌Aspergillus oryzaeに由来するP450を用いた検討を継続する。分析条件は本年度までに確立しており、期間内の一斉分析が可能である。さらに、トリテルペノイド生産に有望な複数のP450を酵母細胞内で共発現させ、より複雑な構造の化合物生産に繋げる。
また、植物型トリテルペノイドの生産を目的として、ルペオール合成酵素と真菌P450の異種発現技術を確立する。本技術により、ルペオールが水酸化されたベツリン酸の生産が可能になると期待され、次年度前期に共発現技術を開発し、次年度後期に一斉分析を終了する予定である。
また、トリテルペノイド生産に利用可能なP450は大腸菌等を用いて大量に発現させ、精製酵素を用いた機能解析を加えることで酵素特性を明らかにする。酵素の諸特性を明らかにすることで、トリテルペノイドの生産性向上を可能とする重要な知見が得られると期待している。我々は、大腸菌を用いた真菌P450の異種発現技術を開発済であり、速やかに検討を開始することができる。
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