| 研究課題/領域番号 |
16H04982
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
中尾 実樹 九州大学, 農学研究院, 教授 (50212080)
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| 研究分担者 |
杣本 智軌 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40403993)
長澤 貴宏 九州大学, 農学研究院, 助教 (70775444)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 魚類 / 補体 / 補体制御因子 / ホメオスタシス / 創傷治癒 / 生体防御 / 免疫 |
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| 研究実績の概要 |
体全体が粘膜組織に覆われている魚類にとって、その粘膜上皮の完全性は病原微生物の新入・感染を防御する第一線の機能として極めて重要である。本研究は、魚類補体制御因子CD46およびアポトーシス細胞認識分子として知られる補体成分C1qおよびプロパージンが果たすホメオスタシス機能に着目し、魚類上皮組織の健全性維持・強化の補体系による制御機構を解明することを目的とした。
本年度は、まず、コイで同定されているプロパージンアイソタイプ（Pf1、Pf2）の機能分化を、C3アイソタイプとの相互作用の観点から解析した。コイC3の主要なアイソタイプであるC3-H1とC3-2の活性化型アナログをヒドラジン処理によって生成させ、その結果C3分子表面に出現した遊離チオール基を介して、各C3アイソタイプをActivated-thiol Sepharoseビーズ固定化した。このC3固定化Sepharoseを充填したマイクロカラムに部分精製Pf1およびPf2を負荷して通過させて、溶出の遅れを測定してPfとC3との相互作用を解析した。その結果Pf2がPf1よりも両C3アイソタイプに対して高いアフィニティーを示すことが判明し、体表におけるホメオスタシス機能においても、Pf2アイソタイプが重要な役割を果たすことが示唆された。
CD46については、KF-1およびCFS上皮細胞株による上皮シート形成に与える、CD46の影響を解析した。抗CD46抗体でこれら細胞株上に発現したCD46をクロスリンクして刺激し、細胞の形態変化および細胞内のタイトジャンクション構造を観察した。その結果、CD46を刺激すると、上皮細胞シートを形成する細胞の密度が上がり、さらにZO1タンパク質で可視化されたタイトジャンクションの構造が強化されることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
プロパージンのアイソタイプ間の機能の違いを確認できたことで、硬骨魚類におけるプロパージンのホメオスタシス機能解析に必要な分子基盤情報を得ることができた。
上皮細胞におけるCD46の機能については、当初は、細胞シートの電気抵抗をシートの完全性を評価するTransepitherial resistance assayを試みたが、供試した細胞株がアッセイ用の培養基でまったく増殖しないことが判明したために、提供できなかった。しかしながら、通常の培養ディッシュ／プレートで生育した細胞シート中のタイトジャンクション構造を、抗ZO1抗体を用いた蛍光免疫染色で観察することができたので、研究を進展させることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでは、細胞表面のCD46を強制的に刺激・活性化させるために、抗CD46抗体（モノクローナル／ポリクローナル）によって架橋を行ってきたが、今後は、天然のリガンドC3bでCD46を活性化した場合の変化を追跡する。その際に、コイで同定されているC3アイソタイプの中で、実際に粘液中に分泌されているアイソタイプを特定する必要がある。また、C3bを効率よく生成させる手法も確認する。
プロパージン、C1qのホメオスタシス機能については、各成分を認識する抗体を用いて、CD46の場合と同様に、補体活性化と上皮細胞シート健全性との関係を解析する。
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