| 研究課題/領域番号 |
16H05027
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
猪島 康雄 岐阜大学, 応用生物科学部, 教授 (20355184)
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| 研究分担者 |
村上 智亮 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (10728447)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アミロイド / SAA / SAA3 / 上皮 / ムチン / mRNA |
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| 研究実績の概要 |
本年度は昨年度に引き続き、マウスSAA1とSAA3、および前半部をSAA1、後半部をSAA3のアミノ酸配列を持つ組換えキメラタンパクSAA1/3、その逆のSAA3/1を大腸菌で発現、精製した。これらの組換えタンパクをマウス腸管上皮由来株化細胞CMT-93に添加し、粘膜免疫関連サイトカイン等のmRNA発現をリアルタイムPCRにより定量し、より詳細な比較解析を実施し、以下の成果を得た。
・CMT93細胞へのSAA1およびSAA3組換えタンパクの添加により、炎症性サイトカインIL-6およびTNF-α、腸管粘液の主成分であるムチン(MUC2)のmRNA発現がSAA3添加で有意に上昇することを明らかにした。一方、SAA1添加では有意な上昇が認められなかった。これらのことから、腸管においてSAA3は、炎症反応などを含めた生体防御に関与していることが示唆された。
・SAA1/3、およびSAA3/1組換えキメラタンパクの添加により、これらのmRNA発現上昇はSAA3/1では認められたが、SAA1/3では認められなかった。以上のことから、SAA3アミノ酸配列の前半部分にSAA3が持つ細胞に対する生物活性に重要な機能領域が存在していることが明らかとなった。
・組換えタンパクSAA3およびSAA3/1添加によるCMT-93細胞でのIL-6、TNF-α、MUC2 mRNA発現の上昇が、組換えタンパクに含まれる6xHisタグによる非特異的な影響ではないことを、SAA1、SAA1/3、および空ベクター発現タンパクを同様に添加した実験により確認できた。
・TNF-α、NF-κB、TLR4/MD2、それぞれの阻害剤を用いた実験により、SAA3の前半部分がTLR4/MD2複合体と結合、NF-κBシグナル伝達経路を活性化することで、MUC2、IL-6、TNF-α mRNA発現を上昇させることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
生物活性のあるマウスSAA3組換えタンパク、およびSAA3/1の作製、精製に成功し、当初の目的であったSAA3の機能領域が前半部分に存在することを明らかにできた。SAA3により発現が誘導される遺伝子を同定することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
SAA3が生体内で腸管上皮以外の上皮細胞でも同様な生物活性を有しているか解明するため、肺胞上皮細胞を使ったインビトロ実験を実施する。また、摘出したマウスの肺を使ってエックスビボでも解析する。
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