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2017 年度 実績報告書

受精卵への顕微注入に拠らない簡便な動物個体ゲノム操作法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 16H05049
研究機関防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛

研究代表者

中村 伸吾  防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 防衛医学研究センター 医療工学研究部門, 講師 (00505323)

研究分担者 石原 雅之  防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 防衛医学研究センター 医療工学研究部門, 教授 (10508500)
佐藤 正宏  鹿児島大学, 学内共同利用施設等, 教授 (30287099)
大塚 正人  東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード遺伝子導入 / ゲノム編集 / 遺伝子改変マウス / 発生工学
研究実績の概要

近年、CRISPR/Cas9システム(CRISPR系)などのゲノム編集技術が登場し、それを用いた動物個体における標的遺伝子のノックアウト(KO)実験は、隆盛を極めつつある。その主流は、受精卵へCRISPR系の核酸成分(mRNA)を直接顕微注入する「zygote injection(受精卵への顕微注入)」であるが、そのためには、高価な装置とそれを操作する人的スキル、受精卵の採取、注入胚の仮親マウス生殖道への移植等の煩雑な処置が必要となる。本研究では、この様な「受精卵への顕微注入」には拠らない、遺伝子改変個体を簡便に作製するための新たな技術を模索する。具体的には、我々が開発をした幾つかの簡便な遺伝子導入手法について、CRISPR系ゲノム編集技術の適用を検討し、これを遺伝子改変マウス作製のための新たな基盤技術として活用したいと考えている。
平成29年度は、(1)エレクトロポーレーションによって輸卵管内の受精卵に遺伝子を導入することの出来る系にCRISPR系を適用して遺伝子組換えマウスを作り出す方法(GONAD)の改良とその応用に関する実験、(2)妊娠中期胎仔マウスに対して母体静脈血から胎盤を経由させて遺伝子導入を行う系(TPGT)を利用して、CRISPR系を導入する実験、(3)卵巣および精巣に対する遺伝子導入系を利用してCRISPR系を導入する実験を行った。
その結果、(1)GONADの効率向上、そして、モデル動物の作製における有用性を示す知見が得られた。(2)TPGTによりCRISPR系成分を胎仔へ導入する事が可能であり、導入されたCRISPR系が当該胎仔で機能することを示すデータが得られた。一方、(3)については、実験の手技的な要素を含む予備検討を実施したが、前向きなデータを得ることが出来ず、実験手技を含めて再検討が必要であると思われた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

申請書に記載した平成29年度の研究計画に基づいた研究内容を実施できた。研究はおおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

本年度の実験結果を踏まえる共に、研究計画調書にしたがって、次年度は以下の2項目を特に研究の中心に据える。そして、最終年度としての研究総括を実施する。
1)妊娠中期胎仔マウスに対する遺伝子導入系を利用したCRISPR系の導入実験を、本年度に引き続いて実施する。具体的には、マウスの内在性遺伝子を標的としたCRISPR系を準備し、これを胎仔マウスへ導入する。これにより、マウスの内在性遺伝子のゲノム編集の可否について評価を行う。
2)マイクロインジェクションを用いずに、CRISPR系を含む核酸類を卵子(着床前胚)へ簡単に導入するための方法を引き続き検討する。具体的には、核酸類を卵子(着床前胚)の透明帯を通過させて内部へ導入させることが可能とされている試薬、あるいはそれに役立つと思われる試薬などを利用する方法の検討や、エレクトロポーレーションに代わり得る核酸の透明帯通過に寄与する遺伝子導入手法を用いた検討を継続する。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (8件) (うち国際共著 1件、 査読あり 8件、 オープンアクセス 6件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases2018

    • 著者名/発表者名
      Ohtsuka Masato、Sato Masahiro、Miura Hiromi、Takabayashi Shuji、Matsuyama Makoto、Koyano Takayuki、Arifin Naomi、Nakamura Shingo、Wada Kenta、Gurumurthy Channabasavaiah B.
    • 雑誌名

      Genome Biology

      巻: 19 ページ: 1~15

    • DOI

      10.1186/s13059-018-1400-x

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Timing of CRISPR/Cas9-related mRNA microinjection after activation as an important factor affecting genome editing efficiency in porcine oocytes2018

    • 著者名/発表者名
      Sato Masahiro、Kosuke Maeda、Koriyama Miyu、Inada Emi、Saitoh Issei、Ohtsuka Masato、Nakamura Shingo、Sakurai Takayuki、Watanabe Satoshi、Miyoshi Kazuchika
    • 雑誌名

      Theriogenology

      巻: 108 ページ: 29~38

    • DOI

      10.1016/j.theriogenology.2017.11.030

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Protective effect of FGF-2 and low-molecular-weight heparin/protamine nanoparticles on radiation-induced healing-impaired wound repair in rats2017

    • 著者名/発表者名
      Kinoda Jun、Ishihara Masayuki、Nakamura Shingo、Fujita Masanori、Fukuda Koichi、Sato Yoko、Yokoe Hidetaka
    • 雑誌名

      Journal of Radiation Research

      巻: 59 ページ: 27~34

    • DOI

      10.1093/jrr/rrx044

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Efficient Generation of Somatic Cell Nuclear Transfer-Competent Porcine Cells with Mutated Alleles at Multiple Target Loci by Using CRISPR/Cas9 Combined with Targeted Toxin-Based Selection System2017

    • 著者名/発表者名
      Sato Masahiro、Miyoshi Kazuchika、Nakamura Shingo、Ohtsuka Masato、Sakurai Takayuki、Watanabe Satoshi、Kawaguchi Hiroaki、Tanimoto Akihide
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 18 ページ: 1~19

    • DOI

      10.3390/ijms18122610

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Stability of Weakly Acidic Hypochlorous Acid Solution with Microbicidal Activity.2017

    • 著者名/発表者名
      Ishihara Masayuki、Murakami Kaoru、Fukuda Koichi、Nakamura Shingo、Kuwabara Masahiro、Hattori Hidemi、Fujita Masanori、Kiyosawa Tomoharu、Yokoe Hidetaka
    • 雑誌名

      Biocontrol Science

      巻: 22(4) ページ: 223~227

    • DOI

      10.4265/bio.22.223

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Cleansing technique using high-velocity steam?air micromist jet spray2017

    • 著者名/発表者名
      Fukuda Koichi、Ishihara Masayuki、Murakami Kaoru、Nakamura Shingo、Sato Yoko、Kuwabara Masahiro、Fujita Masanori、Kiyosawa Tomoharu、Yokoe Hidetaka
    • 雑誌名

      Journal of Medical Engineering & Technology

      巻: 41 ページ: 522~528

    • DOI

      10.1080/03091902.2017.1364309

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Intrapancreatic Parenchymal Injection of Cells as a Useful Tool for Allowing a Small Number of Proliferative Cells to Grow In Vivo2017

    • 著者名/発表者名
      Sato Masahiro、Saitoh Issei、Murakami Tomoya、Kubota Naoko、Nakamura Shingo、Watanabe Satoshi、Inada Emi
    • 雑誌名

      International Journal of Molecular Sciences

      巻: 18 ページ: 1~12

    • DOI

      10.3390/ijms18081678

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Improved Survival of Full-Thickness Skin Graft With Low-Molecular Weight Heparin-Protamine Micro/Nanoparticles Including Platelet-Rich Plasma2017

    • 著者名/発表者名
      Takabayashi Yuki、Ishihara Masayuki、Kuwabara Masahiro、Takikawa Makoto、Nakamura Shingo、Hattori Hidemi、Kiyosawa Tomoharu
    • 雑誌名

      Annals of Plastic Surgery

      巻: 78 ページ: 562~568

    • DOI

      10.1097/SAP.0000000000001051

    • 査読あり
  • [学会発表] 少数個の増殖性細胞の体内増殖を可能とする新規マウス膵臓内細胞移植法2017

    • 著者名/発表者名
      佐藤 正宏,齋藤一誠,村上智哉,窪田直子,中村伸吾,渡部聡,稲田絵美.
    • 学会等名
      第40回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] 卵管内受精卵を標的とした生体内ゲノム編集法(GONAD)習得のための2日間プロトコール2017

    • 著者名/発表者名
      大塚正人,中村伸吾,CB. Gurumurthy,Naomi Arifin,Md Atiqul Islam,三浦浩美,佐藤正宏.
    • 学会等名
      第51回日本実験動物技術者協会総会
  • [学会発表] 銀ナノ粒子含有複合材料による殺微生物・ウイルス不活化効果2017

    • 著者名/発表者名
      中村伸吾,佐藤洋子,桑原征宏,福田孝一,安藤尚子,後藤寿美代,藤田真敬,石原雅之.
    • 学会等名
      日本防菌防黴学会 第44回年次大会
  • [学会発表] 水蒸気・空気混相マイクロミストジェット噴射による洗浄―その医療・獣医療応用への基礎的研究2017

    • 著者名/発表者名
      福田孝一,中村伸吾,佐藤洋子,後藤寿美代,安藤尚子,藤田真敬,石原雅之.
    • 学会等名
      日本防菌防黴学会 第44回年次大会
  • [学会発表] 大腸菌群および一般生菌の増殖と光照射による飲料水中の亜硝酸態窒素の挙動分析2017

    • 著者名/発表者名
      佐藤洋子,中村伸吾,後藤寿美代,安藤尚子,福田孝一,藤田真敬,石原雅之.
    • 学会等名
      日本防菌防黴学会 第44回年次大会

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公開日: 2018-12-17  

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