| 研究課題/領域番号 |
16H05150
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
宮澤 恵二 山梨大学, 総合研究部, 教授 (40209896)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | TGF-β |
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| 研究実績の概要 |
１．細胞応答阻害性ペプチドを用いたSmad cofactorの同定
JygMC(A)細胞は自己分泌するTGF-β依存的にアポトーシス抵抗性を示す。Smad3-MH2ドメインの部分ペプチドがこの細胞応答を抑制することを見出しており、JygMC(A)細胞抽出液中のSmad3-MH2結合タンパク質の中からペプチドで結合が阻害されるタンパク質を探索した。しかし、候補タンパク質が非常に多く、同定には至らなかった。一方、siRNAを用いた実験により、あるbHLH型転写因子をノックダウンすることにより、TGF-β依存的なアポトーシス抵抗性が消失することを見出した。この候補因子に関して動物実験を行うため、現在、shRNAを用いた安定ノックダウン細胞の樹立を進めている。
２．次世代シークエンサーを用いた内因性Smad結合配列の収集
ヒト肝がん細胞株HepG2、およびヒト肺がん細胞株A549を用いてCasting法と次世代シークエンサーを組み合わせたSmad結合配列の収集を行い、ヒト正常角化細胞株HaCaTから収集した配列と比較検討した。その結果、典型的なSmad結合モチーフを持たないものも含め、細胞種にユニークな配列が収集できることが明らかとなった。これらの配列のうち、出現頻度が高いものをpGL4ルシフェラーゼレポーターベクターに組み込み、TGF-β刺激に対して活性上昇の応答性が良いものをピックアップし、Smad依存性の確認、応答に必須領域の絞り込みを進めた。こうして、未知のSmad cofactorに応答していると思われるSmad結合配列を複数、得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞応答阻害性ペプチドを用いたアプローチでは、当初、計画していたプロテオミクスの方法で期待した結果は得られなかったが、別の方法でTGF-β依存的なアポトーシス抵抗性に関与していると思わる候補因子を見出すことができた。したがって、実質的な遅れは生じていないと考えている。
一方、次世代シークエンサーを用いた内因性Smad結合配列の収集に関しては、研究協力者（助教）が退職したこともあって、実験にやや遅れが生じた。現在では新たな協力者を得て体制を整えたので、今後は急速にキャッチアップできると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞応答阻害性ペプチドを用いたアプローチは手法として拡張性があるので、改良を試みる。また、得られた候補因子の機能解析を進める。
Smad結合配列の収集は、高悪性度のがん細胞を中心に探索に用いる細胞株を増やすとともに、すでに得られた配列の解析を進める予定である。
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