| 研究課題/領域番号 |
16H05150
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
宮澤 恵二 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40209896)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | がん / シグナル伝達 |
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| 研究実績の概要 |
1. 細胞応答阻害性ペプチドを用いたSmad cofactorの同定
本手法で乳がん細胞株JygMC(A)細胞のアポトーシス抵抗性に関与するSmad cofactorの同定を進めている。高度に精製したSmad3-MH2組換えタンパク質を用いて細胞の核抽出液からSmad結合タンパク質のpull-downを行ったが、質量分析にかけられるようなシグナルは得られなかった。一方、項目２からJygMC(A)細胞の各抽出液から内因性Smad結合配列を得ることができた。これらのDNA配列へのSmad結合に対する細胞応答阻害性ペプチドの効果を検定する実験系を作成している。
2. 次世代シークエンサーを用いた内因性Smad結合配列の収集
前年度までのヒト細胞株（HaCaT、HepG2、A549）に引き続き、マウス乳がん細胞株4T1、JygMC(A)、マウス乳腺正常上皮細胞株NMuMG細胞を用いて内因性Smad結合配列の収集を進めた。得られた配列の多くは、MEME法によるモチーフ検索でSmad cofactorの候補となる転写因子を推定できた。これらの配列をpGL4ベクターに組み込み、TGF-β依存性の良好なレポーター活性を示す配列を複数、同定した。また、これらのレポーター活性はSmad結合モチーフ及びcofactor結合モチーフへの変異導入で顕著に低下した。したがって、SmadとSmad cofactorとの協調作用で転写活性化を行う配列であると判断した。このうち、２つのSmad cofactor候補タンパク質について、publicなデータベースを用いた解析により、がん悪性化との関連が示唆されたので、今後の解析のためにcDNAを取得し、発現ベクターに組み込んだ。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. 細胞応答阻害性ペプチドによるSmad cofactorの同定研究は、Smad3-MH2組換えタンパク質を高度に精製して用いても満足な結果を得ることができなかった。しかし、実験材料に用いていたJygMC(A)細胞から内因性Smad結合配列を収集できた。これら配列のSmad結合に対するペプチドの阻害効果を検定する実験系を導入することにより、適切にバックアップできると考えている。
2. 内因性Smad結合配列の収集は、がん悪性化に関与すると考えられるSmad cofactorの候補を２つ見出すことができたので、順調に進行したと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次世代シークエンサーを用いた内因性Smad結合配列の探索法は、MEME法によるモチーフ検索と組み合わせると、プロテオミクスの手法を用いることなくSmad cofactor候補をピックアップできることがわかった。したがって、この手法を中心に据えて、がん悪性化に関与するSmad cofactorの同定を推進する。
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