研究課題
申請者は、乳がんにおいて高頻度に発現亢進を認める式エストロゲン受容体（ER)活性化制御分子BIG3が、エストロゲン（ER2)依存性乳がんにおいて、どのような病態生理機能を果たし発がん進展に寄与しているのか、BIG3によるER活性抑制因子（PHB2）の制御機構およびBIG3ノックアウトマウスを用いた生理機能を解明し、最終的には重篤な副作用を起こさないBIG3-PHB2相互作用阻害治療薬を開発を目標としている。本研究計画では、BIG3がセリン／スレオニンプロテインホスファターゼPP1αとの結合モチーフが保存されていること、他のBIGファミリータンパク質にて認められるA-kinase achoringモチーフ（PKA、PP1との複合体を形成して、scafoldingとして機能するタンパク質のモチーフ）が保存されていることから、BIG3は、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼPP1αの調節サブユニットとして機能し、体細胞変異もメチル化も認められないエストロゲン受容体（ER）活性抑制因子PHB2(Prohibitin2)をその基質として結合することで不活化するという仮説を立て、その証明を進めている。予定している具体的な検証項目は 1.BIG3のPP1αの調整サブユニットとしての機能解析 2.PHB2を標的としたキナーゼの同定 3.BIG3/PHB2複合体のミトコンドリアにおける機能解明およびBIG3およびBIG3新規結合タンパク質の探索 4.BIG3/PHB2相互作用阻害ペプチドおよび阻害化合物の開発 5.乳がん臨床検体収集と大規模検体を用いた免疫組織染色と相関解析 6.BIG3ノックアウトマウス解析 の6項目である。平成28年度中に、1について検証、2.4について着手しており、本年度は、2.4の追加解析および3について着手した。
2: おおむね順調に進展している
研究期間中に予定している検証6項目のうち（1.BIG3のPP1αの調整サブユニットとしての機能解析 2.PHB2を標的としたキナーゼの同定 3.BIG3/PHB2複合体のミトコンドリアにおける機能解明およびBIG3およびBIG3新規結合タンパク質の探索 4.BIG3/PHB2相互作用阻害ペプチドおよび阻害化合物の開発 5.乳がん臨床検体収集と大規模検体を用いた免疫組織染色と相関解析 6.BIG3ノックアウトマウス解析）当年度、3項目(2・3・4）について下記成果を上げた。検証項目2について、ER陽性乳がん細胞におけるBIG3-PKA-PP1α複合体に結合するPHB2のS39は、エストロゲン存在下では常に脱リン酸化しているが、これはS39の責任キナーゼであるPKCαが、BIG3に結合済みのPHB2には結合できないことに起因していること、一方、BIG3-PHB2相互作用阻害ペプチドERAPを投与することによってBIG3から解離したPHB2は迅速にPKCαと結合しS39がリン酸化することを明らかにした。検証項目3について、BIG3/PHB2複合体のミトコンドリアにおける機能を精査したところ、BIG3-PHB2相互作用阻害ペプチドERAP投与によるROSの産生増加とPHB2の核内への移行が認められた。検証項目4について、前年度に引き続き、BIG3/PHB2相互作用阻害ペプチドおよび阻害化合物の開発に係わる分子内架橋型ERAP(stERAP)の性能を精査したところ、stERAPは従来型ERAPよりもPHB2への結合度が高く、アルファヘリックス構造が維持されており、細胞膜および核内への移行が投与後１時間以内に迅速に認められた。
前年度までの成果をもとに、前述した検証6項目のうち（1.BIG3のPP1αの調整サブユニットとしての機能解析 2.PHB2を標的としたキナーゼの同定 3.BIG3/PHB2複合体のミトコンドリアにおける機能解明およびBIG3およびBIG3新規結合タンパク質の探索 4.BIG3/PHB2相互作用阻害ペプチドおよび阻害化合物の開発 5.乳がん臨床検体収集と大規模検体を用いた免疫組織染色と相関解析 6.BIG3ノックアウトマウス解析）着手中および未検証の4~6について下記研究を続行する。検証項目4について、BIG3-PHB2結合阻害ペプチドERAPのD体化改良型を合成し、ER陽性乳癌細胞を用いた腫瘍効果を検討する。検証項目5について、BIG3/PHB2相互作用阻害ペプチドの継続および乳がん臨床検体を用いて、BIG3とPHB2の発現を免疫組織染色および臨床病理学的所見との相関解析をすすめてる。特にPHB2のリン酸化とBIG3発現に関係について、予後などの臨床情報との相関解析を行い、バイオマーカーとしての評価を進める。検証項目6について、BIG3ノックアウトマウスを用いた分化成熟過程におけるBIG3・PHB2の機能および各臓器における組織学的生化学的解析を進める。
すべて 2018 2017
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件、 招待講演 4件)
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