研究課題
LPS刺激マウス骨髄マクロファージのNLRP3を免疫沈降法により回収し、質量分析によりNLRP3のリン酸化部位の同定を試みた。しかし全長のNLRP3アミノ酸配列をカバーすることは予想以上に困難であった。一方、昨年度作製したBTK-KO THP-1細胞クローンではNLRP3インフラマソームの活性化が低下していることが確認できた。一方、本研究と並行してLPS刺激マウス骨髄マクロファージ中のNLRP3の結合因子を免疫沈降と質量分析により複数同定した。その中でもF-actin調節因子gelsolinに着目して研究を進めた。Gelsolin遺伝子（Gsn）欠損J774-1細胞（マウスマクロファージ株）クローンではnigericin刺激により過剰のcaspase-1の活性化とpyroptosisの誘導が認められた。即ち、gelsolinはNLRP3インフラマソームの形成抑制因子であることが示唆された。加えて、Gsn欠損J774-1細胞ではcaspase-3の活性化も亢進していた。つまりgelsolinはマクロファージの2種類のプログラム細胞死apoptosisとpyroptosisを制御し、炎症環境下でのマクロファージ死を抑制していると考えられる。その生理的意義を明らかにするため、CRISPR/Cas9システムを用いてGsn-floxedマウスの作製に着手した。現在PCRスクリーニングにより子マウス中にGsn-floxed founderマウスが存在するか確認している。
2: おおむね順調に進展している
当初の目的であるNLRP3リン酸化修飾については技術的な改善が必要であるが、その一方で、LPS刺激マクロファージ中のNLRP3と相互作用する細胞内分子を複数同定した。中でもgelsolinがNLRP3インフラマソームの形成抑制因子であることを見出し、炎症環境下でのマクロファージの生存を促しているというユニークな機能を発揮している可能性を見出した。更に、その生体内での生理的意義の解明に向けて、遺伝子改変マウスの作製に着手できたため。
先ず、gelsolinのNLRP3インフラマソーム形成抑制の分子機序を解明する。特にNLRP3インフラマソーム形成の場であるミトコンドリアとの関連に焦点を当てる。具体的にはNLRP3インフラマソーム活性化の際にgelsolinが結合するミトコンドリア膜上の分子を同定し、その後同定された分子の欠損J774-1細胞クローンを作製する。その後インフラマソームの活性誘導に対するプログラム細胞死を評価する。上記と並行して、Gsn-floxed founderマウスよりマクロファージ特異的Gsn欠損マウスを作製し、炎症モデル（敗血症、痛風、接触性皮膚炎）実験を施行する。野生型及びNLRP3欠損マウスと比較する。一方、腫瘍浸潤マクロファージに対する機能を解明するために、担がんマウスの作製も行う。
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すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (2件)
Nature Communications volume
巻: 8 ページ: 15338
10.1038/ncomms15338
Annals of the Rheumatic Diseases
巻: 76 ページ: 1458-1466
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