研究課題
エンテロウイルスA71(EV-A71)は、手足口病の主要な原因ウイルスであるとともに、小児を中心とした致死的EV71脳炎を含む重症中枢神経疾患発症に関与する。しかし、EV-A71感染における重症中枢神経疾患の発症機構は明らかにされておらず、ヒトにおける重篤化を規定するウイルス側・宿主側因子は特定されていない。EV-A71カプシド蛋白質の特定のアミノ酸(VP1-145等)は、分離株間で多様性を有し、①PSGL-1受容体特異性、②マウスモデルにおける病原性、③中和抗原性エピトープ、④ヘパラン硫酸結合性、⑤ヒトEV-A71感染重篤化への関与の可能性等、さまざまなウイルス表現型に関与する。我々は、「宿主におけるエンテロウイルス71カプシド適応変異と受容体特異性・病原性の変化[基盤研究B](平成25年～平成28年)」により、特定のEV-A71カプシドアミノ酸(VP1-145等)は、カニクイザル感染個体内で速やかに変異し、quasi-speciesを生じることを明らかにした。今年度は、カニクイザル感染モデルを用いた解析により、異なる遺伝子型のEV-A71株においても、VP1-145が神経病原性を規定するカプシドアミノ酸であることを確認した。EV-A71感染マウスモデルの改良を図るため、ヒト受容体特異性を反映した機能の異なる複数のEV-A71受容体を発現したノックインマウスの作製を進めた。さらに、感染動物組織等からEV-A71カプシド遺伝子を直接増幅し、次世代シークエンス解析により感染個体内におけるEV-A71ゲノム変異およびquasi-speciesの出現を網羅的かつ定量的に解析する手法を検討した。
2: おおむね順調に進展している
我々は、「宿主におけるエンテロウイルス71カプシド適応変異と受容体特異性・病原性の変化[基盤研究B](平成25年～平成28年)」によるカニクイザル感染実験により、PSGL-1結合性を含む多様なウイルス学的性状および神経病原性を規定する特定のEV-A71カプシドアミノ酸(VP1-145等)は、感染個体内で速やかに変異し、quasi-speciesを生じることを明らかにした 。本年度は、カニクイザル感染モデルを用いた解析により、異なる遺伝子型のEV-A71株においてもVP1-145が病原性を規定すること、VP1-145EからVP1-145Gへのアミノ酸変異がカニクイザルにおけるEV-A71弱毒化に関与することを確認した。EV-A71感染マウスモデルの改良を図るため、ヒト受容体特異性を反映した機能の異なる複数のEV-A71受容体を発現したノックインマウスの作製を進めた。CRISPR/Cas9を用いES細胞内でEV-A71受容体遺伝子の相同組換えを起こし、ES細胞とレシピエント卵を代理母マウスに移植しキメラマウスを作製した。野生型マウスとの交配により、異なる複数のEV-A71受容体を単独あるいは同時に発現するノックインマウスを得ており、今後、EV-A71感染実験を試みる予定である。感染動物組織等から、培養細胞によるウイルス分離を経ずにEV-A71カプシド遺伝子を増幅し、次世代シークエンス解析により個体内変異およびquasi-speciesの出現を網羅的かつ定量的に解析するための条件検討を進めた。ランダムプライマーを用いた非特異的遺伝子増幅、および、高感度カプシド遺伝子増幅法であるECRA法等エンテロウイルス特異的プライマーを用いた方法による次世代シークエンス解析による検出感度や遺伝子解析精度を比較し方法の至適化を図った。
VP1-145等カプシド可変領域の分子進化により多様な表現型を示すEV-A71バリアントの個体内・個体間適応戦略の解析を進める。EV-A71ゲノム分子進化の過程で生じる多様な表現型を示すEV-A71バリアントの個体内・個体間適応戦略の解析を進めることにより、EV-A71による神経病原性発現機構の解明が期待できる。特定のカプシドアミノ酸変異により規定されるウイルス学的多様性と中枢神経病原性発現の関連性の解明を目指す。本年度は、以下の研究課題について検討を進める予定である。1.ヒトに近い動物モデルであるカニクイザル感染モデルを用いて、PSGL-1結合性、ヘパラン硫酸結合性、抗原性等多くのウイルス表現型に関与するVP1-145変異株感染による、中枢神経病原性、組織特異的ウイルス増殖、感染個体内におけるカプシドアミノ酸適応変異等についての解析を進める。2.EV-A71感染マウスモデルの改良を図るため、ヒト受容体特異性を反映した、機能の異なる複数のEV-A71受容体を発現したノックインマウスの作製を進める（前年度から継続）。ノックインマウスが樹立され次第、PSGL-1結合性の異なるEV-A71 variantを用いた感染実験を試み、受容体指向性と病原性発現の関連について解析する。3.感染動物モデルにおけるEV-A71ウイルスゲノム多様性、個体内変異、quasi-speciesを解析するため、EV-A71カプシド遺伝子増幅および次世代シークエンス解析の至適化を進める。
すべて 2018 2017
すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 2件、 査読あり 5件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 4件、 招待講演 1件)
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