研究課題
本研究では、胸腺上皮細胞の分化機構とT細胞分化制御の分子基盤を理解することを目的とする。特に、通常のαβT細胞に加え、未だ理解が進んでいないγδT細胞のレパトア形成と機能分化の制御原理の解明に挑戦する。① 皮質上皮細胞（cTEC）と髄質上皮細胞（mTEC）の分化制御機構について、RANK-Cre-IRES-GFPマウスを用いて解析を行った。胎仔期の胸腺上皮前駆細胞（pTEC）は、cTECとmTECに特有の遺伝子群を一旦発現し、その後どちらかの細胞系譜に特殊化して分化することがわかった。また、RANKLのコンディショナルKOマウス、および膜型または可溶型のRANKLをそれぞれ欠損する変異マウスを作製し、CD4SP胸腺細胞に発現される膜型RANKLがmTEC分化に必須であることを明らかにした。② 胸腺微小環境によるαβT細胞レパトア制御を理解するためのTCRシークエンス解析法を確立した。cTECの機能分子であるβ5tの変異マウスを対象として解析を行った結果、β5t変異によってTCRレパトアの一部が失われ、個体間のTCRの差異が増加することを明らかにした。③ γδT細胞レパトア形成を制御する候補因子である11個のSkint遺伝子を欠損するマウス（SKLD）を作製し表現型解析を行った。SKLDマウスではVg5Vd1 gdT細胞の胸腺内分化と皮膚への局在が大きく障害されていた。しかし、それ以外のgdT細胞やabT細胞、B細胞、骨髄系細胞の分化には変化はみられなかった。従って、Skintファミリー遺伝子はVg5Vd1 gdTの制御に特化した役割をもつことが示唆された。また、本研究で作製した可溶型RANKL欠損マウスを他の免疫組織微小環境の研究に活用し、腸管上皮M細胞の分化を制御する新規のストロマ細胞を同定することができた。
2: おおむね順調に進展している
胎仔期のpTECからcTECまたはmTECへと分化する制御機構の一端を明らかにすることができた。また、RANKLのコンディショナルKOマウスを用いて、CD4SP胸腺細胞に発現されるRANKLがmTEC分化に必須であることを示した。さらに、膜型または可溶型のRANKLをそれぞれ欠損するdeltaM、deltaS変異マウスを作製し、RANKLによるmTEC分化制御は膜型RANKLによって制御されることを明らかにした。可溶型RANKLを欠損するdeltaSマウスについては、他の免疫微小環境の研究にも活用し、腸管上皮M細胞の分化を制御する新規のストロマ細胞を同定することができた。当初の計画以上の成果が得られたが、RNA-seq解析によるpTECの性状解析など、未解決課題も残っている。αβT細胞レパトア形成については、当初の計画通り、ポリクローナルなTCRレパトアを網羅的に解析する手法を確立した。cTECの機能分子であるβ5tの変異マウスを対象とし、特定のTCRレパトア喪失や個体間のTCR多様性の増加を定量的に示すことができた。さらにFezf2等のmTEC機能分子についても同様のTCRレパトア解析を計画している。γδT細胞レパトア形成については、SKLDマウスの解析によって、Skintファミリー遺伝子は皮膚のVg5Vd1 gdTの制御に特化した役割をもつことを明らかにした。さらに、このマウスに特定のSkint遺伝子を発現させ、Vg5Vd1 gdT細胞の分化を制御する分子機序を解明する計画を進めている。
cTECに高発現する転写因子Klf15のconditional KOマウスの表現型解析を進める。cTECに特徴的な多細胞複合体「胸腺ナース細胞」の形成能や、β5t、Dll4、IL-7などの機能分子の発現を指標として、定性的かつ定量的な解析を行う。また、mTECの分化を制御するサイトカインRANKLの作用機序を明らかにするため、膜型または可溶型RANKLを特異的に欠損するマウス、およびRANKL conditional KOマウスを対象としてmTECの分化と機能、胸腺T細胞分化、自己免疫病態への影響を解析する。さらに、胸腺の皮質・髄質微小環境の形成機構を理解するため、TECに加えて、間葉系ストロマ細胞を対象として研究を進める。間葉系細胞をフローサイトメーターによってサブセットごとに単離し、遺伝子発現解析によって特徴づけを行う。前年度に確立したαβT細胞レパトア解析法を活用し、Fezf2欠損マウスやβ5t変異マウスにおけるT細胞レパトアへの影響を重点的に解析する。同定されたTCRα鎖については、当該TCRα/β複合体を発現するレトロジェニックマウスを作製し、胸腺内分化運命を検証するとともに、定常状態および実験的誘発時の自己免疫病態を解析する。γδT細胞については、SKLDマウスに特定のSkint遺伝子を単独または複数導入し、皮膚γδT細胞の分化が回復するかどうかを調べることで、γδT細胞のレパトア形成を制御する胸腺環境因子の最小単位を明らかにする。この課題に関しては、Adrian Hayday博士（英国King’s College London）との共同研究を実施する。また、胎仔胸腺におけるγδT17細胞の分化制御機構を明らかにするため、胎仔胸腺およびγδT17前駆細胞に発現する因子のKOマウスを作製し、表現型解析を行う。
すべて 2017 2016
すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 2件、 査読あり 2件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 3件)
Nature Immunology
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
doi:10.1038/ni.3732
Journal of Bone and Mineral Research
巻: 32 ページ: 434-439
doi: 10.1002/jbmr.2990
