ラマン散乱光分析とインピーダンス測定を組み合わせた新しい組織診断技術の開発

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16H05238
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 高成 広起 徳島大学, 病院, 特任講師 (70723253)
• 研究分担者: 井上 高教 大分大学, 工学部, 准教授 (40243969) ; 芦原 貴司 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (80396259) ; 橋本 悟 徳島大学, 病院, 特任講師 (60352150)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 散乱光分析 / 組織インピーダンス / コンピュータ・シミュレーション

研究実績の概要

1. ガラス底培養皿に培養した心筋細胞を用いて、ラマン散乱光分析を試みた。単層に培養された心筋細胞の厚みが薄すぎて、培養皿底面のガラスの散乱光成分が大きく検出されてしまい、心筋細胞に特異的な散乱光の検出が困難であった。この問題を解決するためにガラスの散乱光成分を減算処理して心筋細胞特異的な散乱光を抽出することを試みたが、ノイズが大きすぎて特異的波長成分の検出は困難であった。これらの結果から、培養細胞を用いた実験系は本研究に適さないと判断し、摘出心臓組織を用いた実験系に急遽変更し、ブタ摘出心臓の心房組織を用いて散乱光分析を行った。この結果、心房組織の内膜側と外膜側で心筋組織に特異的な散乱光ピークを複数検出することができた。
2. 培養細胞のインピーダンス測定を、Multi-Electrode Array（64電極）を用いて実施した。心筋細胞を単独で培養した場合に比べて、骨格筋芽細胞と心筋細胞を共培養した場合の方がインピーダンスが高く測定された。また心筋細胞単独で培養した場合は各電極間のインピーダンスが均一であったのに対し、骨格筋芽細胞と心筋細胞の共培養では電極間のインピーダンスにばらつきを認めた。これらは概ね研究仮説に沿う結果であった。ただし、本研究設備はインピーダンスの定量性に欠けること、また散乱光分析が培養細胞を用いた実験系では困難なこと、などの理由により、インピーダンス測定も摘出心臓組織を用いた実験系に変更する方針とし、平成28年度末～平成29年度初頭にこれら実験機器を揃えることとした。
3. コンピュータ上で心筋細胞の電気生理学的特性を組み込んだバイドメイン・モデルを作成した。引き続き、交流電流印加のプログラムを作成中で、平成29年度にシミュレーションを開始できる体制を整えている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画では培養細胞を用いて実験を遂行する予定であったが、培養心筋細胞の光学的計測が困難であることが実験を進める中で判明した。そこで、摘出心臓組織を用いた組織実験に切り替えて散乱光分析を行うことで、計画を支障なく遂行できている。また散乱光分析に先行していたインピーダンス測定では培養細胞を用いていたが、散乱光分析とインピーダンス測定を同時に行うという本研究の趣旨に照らし合わせ、摘出心臓組織用のインピーダンス測定機器を揃えることで、対象が培養から摘出組織に変わったとはいえ、概ね当初の計画通りに実験を進めることができている。コンピュータ・シミュレーションは既に心臓の電気生理学的特性を入力したバイドメインモデルが完成しており、交流電流印加のプログラミングも進んでいる。いずれも当初の予定通りである。以上の理由から、現在までの進捗は順調であると判断される。

今後の研究の推進方策

次年度～最終年度には光学的計測（散乱光分析）とインピーダンス測定を同時に行うための実験系を構築する。光学分析機器の測定プローブを顕微鏡型から光ファイバー型に変更し、ファイバーを組織に密着させて散乱光分析を行うシステムを完成させる。また、光測定を行なう部位において心外膜側からインピーダンスを直接測定できる多電極プローブおよび組織インピーダンス測定システムを完成させる。これらの測定システムを病態モデル動物（心筋梗塞モデルのマウスもしくはラット）に応用し、心筋梗塞によって生じた心筋線維化を光学分析およびインピーダンス測定によって検出できる、特異的な生体情報の抽出を目指す。
コンピュータ・シミュレーションの分野では、作成したバイドメインモデルに交流電流を印加し、組織内の電流の流れを観察する。特に交流電流の電流量や周波数を変化させた際に、測定される組織インピーダンスや電流が流れる範囲（広さ・深さ）がどのように変化するかをシミュレーションする。また本モデルにも線維化組織を組み込むことで、病態心における交流電流印加の影響を検証し、病態モデルを用いた動物実験の結果と照らし合わせてデータを統合する。
これらのデータから、光情報とインピーダンス情報を組み合わせた新しい組織診断のアルゴリズムを構築することを目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Class III antiarrhythmic drugs amiodarone and dronedarone impair KIR2.1 backward trafficking (2017)
  • 著者名/発表者名: Ji Y, Takanari H, Nalos L, Houtman MJC, Heukers R, van Bergen en Henegouwen PMP, Vos MA, van der Heyden MAG.
  • 雑誌名: Journal of Cellular and Molecular Medicine 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1111/jcmm.13172
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Significance of integrated in silico transmural ventricular wedge preparation models of human non-failing and failing hearts for safety evaluation of drug candidates (2017)
  • 著者名/発表者名: Kubo T, Ashihara T, Tsubouchi T, Horie M
  • 雑誌名: J Pharmacy Toxic Methods 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.vascn.2016.08.007.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] MED12-related XLID disorders are dose-dependent of immediate early genes (IEGs) expression (2017)
  • 著者名/発表者名: Donnio LM, Bidon B, Hashimoto S, May M, Epantchintsev A, Ryan C, Allen W, Hackett A, Gecz J, Skinner C, Stevenson RE, de Brouwer AP, Coutton C, Francannet C, Jouk PS, Schwartz CE, Egly JM
  • 雑誌名: Hum Mol Genet 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1093/hmg/ddx099.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Partial IK1 blockade destabilizes spiral wave rotation center without inducing wave breakup and facilitates termination of reentrant arrhythmias in ventricles (2016)
  • 著者名/発表者名: Kushiyama Y, Honjo H, Niwa R, Takanari H, Yamazaki M, Takemoto Y, Sakuma I, Kodama I, Kamiya K
  • 雑誌名: American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 巻: 311 ページ: H750-H758
  • DOI: 10.1152/ajpheart.00228.2016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Calmodulin/CaMKII inhibition improves intercellular communication and impuslse propagation in the heart, and is anti-arrhythmic under conditions when fibrosis is absent (2016)
  • 著者名/発表者名: Takanari H, Bourgonje VJA, *Fontes MSC, Raaijmakers AJA, Driessen H, Jansen JA, van der Nagel R, Kok B, van Stuijvenberg L, Boulaksil M, Takemoto Y, Yamazaki M, Tsuji Y, Honjo H, Kamiya K, Kodama I, Anderson ME, van der Heyden MAG, van Rijen HVM, van Veen TAB, Vos MA
  • 雑誌名: Cardiovascular Research 巻: 111 ページ: 410-421
  • DOI: 10.1093/cvr/cvw173
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Atrial fibrillation-mediated up-regulation of miR-30d regulates myocardial electrical remodeling of G-protein-gated K+ channel, IK,ACh (2016)
  • 著者名/発表者名: Morishima M, Iwata E, Nakada C, Tsukamoto Y, Takanari H, Miyamoto S, Moriyama M, Ono K
  • 雑誌名: Circulation Journal 巻: 80 ページ: 1346-1355
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-15-1276
  • 査読あり
• [雑誌論文] A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology (2016)
  • 著者名/発表者名: Takanari H, Miwa K, Fu X, Nakai J, Ito A, Ino K, Honda H, Tonomura W, Konishi S, Opthof T, van der Heyden MAG, Kodama I, Lee JK
  • 雑誌名: Journal of Cellular Physiology 巻: 231 ページ: 2249-2256
  • DOI: 10.1002/jcp.25342
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] ジギタリス ー伝統的薬剤を現代医療でどのように用いるか (2016)
  • 著者名/発表者名: 高成広起
  • 雑誌名: 循環器内科 巻: 80 ページ: 3-9
• [雑誌論文] ATP感受性K+チャネル病の新規症候群ーCantu症候群 (2016)
  • 著者名/発表者名: 平木洋子、高成広起
  • 雑誌名: 脳と発達 巻: 48 ページ: 325-331
  • 査読あり
• [雑誌論文] Early repolarization and risk of arrhythmia events in long QT syndrome. (2016)
  • 著者名/発表者名: Hasegawa K, Watanabe H, Hisamatsu T, Ohno S, Itoh H, Ashihara T, Hayashi H, Makiyama T, Minamino T, Horie M
  • 雑誌名: Int J Cardio 巻: 223 ページ: 540-542
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2016.08.215.
  • 査読あり
• [雑誌論文] ヒトiPS細胞から成熟した心筋細胞の開発と安全性評価への応用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 諫田 泰成、芦原 貴司、黒川 洵子
  • 雑誌名: 日本薬理学雑誌 巻: 147 ページ: 334-338
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Splicing misregulation of SCN5A contributes to cardiac-conduction delay and heart arrhythmia in myotonic dystrophy (2016)
  • 著者名/発表者名: Freyermuth F, Rau F, Kokunai Y, Wahbi K, Matsumura T, Fujimura H, Mochizuki H, Deryckere F, Kimura T, Nukina N, Ishiura S, Lacroix V, Campan-Fournier A, Navratil V, Chautard E, Auboeuf D, Horie M, Imoto K, Lee KY, Swanson MS, Lopez de Munain A, Inada S, Itoh H, Nakazawa K, Ashihara T, et al.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 7 ページ: 11067
  • DOI: 10.1038/ncomms11067.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] High Frequency of Early Repolarization and Brugada-Type Electrocardiograms in Hypercalcemia (2016)
  • 著者名/発表者名: Sonoda K, Watanabe H, Hisamatsu T, Ashihara T, Ohno S, Hayashi H, Horie M, Minamino T
  • 雑誌名: Ann Noninvasive Electrocardiol 巻: 21 ページ: 30-40
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanisms of interstrand DNA crosslink repair and human disorders (2016)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto S, Anai H, Hanada K
  • 雑誌名: Genes Environ 巻: 38 ページ: 9
  • DOI: 10.1186/s41021-016-0037-9.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ラマン散乱光分析を用いた皮膚悪性黒色腫の非侵襲的組織診断機器の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 井上高教、橋本悟、高成広起
  • 学会等名: 第4回 TR推進合同フォーラム ライフサイエンス技術交流会
  • 発表場所: 九州大学医学部百年講堂（福岡市、福岡県）
  • 年月日: 2016-10-31 – 2016-10-31
• [学会発表] 不整脈基質におけるギャップ結合と線維化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 高成広起
  • 学会等名: 第1回 START研究会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター（札幌市、北海道）
  • 年月日: 2016-07-14 – 2016-07-14
  • 招待講演