| 研究課題/領域番号 |
16H05317
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
堂浦 克美 東北大学, 医学系研究科, 教授 (00263012)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 遺伝子 / ゲノム / 脳神経疾患 / マイクロアレイ / プリオン |
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| 研究実績の概要 |
私たちの体内にはプリオンの増殖を抑制する機構が備わっており、その機構は何らかの外的要因等の影響を受け、プリオンの増殖をコントロールしている可能性が予想されるが、発病に関わるこれらの生体防御機構については不明である。申請者は、食品添加物等として日常摂取しているセルロースエーテル（ＣＥ）が、プリオン病に対して長期間にわたる優れた発病抑制効果を発揮することを発見した。ＣＥ効果にはマウス系統差(Tg7[遺伝的背景不明]は高感受性、Tga20[B6背景]は低感受性)があるが、Tg7とTga20ではＣＥの体内動態に違いは無い。高感受性系統Tg7を低感受性系統B6と交配した2世代目(Ｆ２)マウス(HaPrP+/-,MoPrP-/-)のＣＥ感受性試験は、きれいに高感受性群と低感受性群の2群に分離できるため、これらの2世代目以降のマウスを用いてSNPアレイによる全ゲノム関連解析を実施し、ＣＥ感受性に関わる候補遺伝子群を同定しようとした。本年度は、高感受性群と低感受性群の各30匹で全ゲノム関連解析を終了したが、得られた候補領域が多数過ぎて絞り込めなかった。そのため、各群100匹分の解析を目指してＦ２マウスの作出ならびにＣＥ感受性試験を行っている途中である。一方、遺伝的背景が全く不明であった高感受性系統Tg7について、全ゲノム関連解析の結果、B10と129/Olaの混血であり、個体により混血の程度が異なることを解明した。さらに、ＣＥ高感受性という表現型は、Tg7マウスのゲノム上のトランスジーンが宿主に与えている影響である可能性もあるため、Tg7マウスの全ゲノムシークエンスを実施してトランスジーンの位置と配列を決定した。そこで、トランスジーンの影響を考察した結果、トランスジーンの影響とＣＥ高感受性を積極的に結びつける材料は見当たらないと結論した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ｆ２高感受性マウスの精子を用いてB6と交配を行い、産仔から(HaPrP+/-,MoPrP-/-)のオスを選抜して、精子を保管後にＣＥ感受性試験（プリオン感染ならびにＣＥ投与実験）を行い3世代目の選抜を行った。また、既に得られているＦ２マウスの高感受性群並びに低感受性群のゲノムDNAをもちいてSNPアレイによる全ゲノム関連解析を実施した。高感受性群と低感受性群の各30匹の全ゲノム関連解析を終了したが、得られた候補領域が多過ぎて絞り込めなかった。このことは予想していたことであったため、当初の計画通り各群100匹分の解析を目指してＦ２マウスの作出・選抜ならびにＣＥ感受性試験を行い、解析匹数を増やしている途中である。一方、一部の3世代目マウスでのＣＥ感受性の判定結果が得られた個体があったため、3世代目の実験と同様に4世代目の作出・選抜ならびにＣＥ感受性試験を行った。しかし、3世代目以降のマウス作出・選抜ならびにＣＥ感受性試験には、予想を超える時間・労力・費用がかかるため、3世代目以降の実験は規模を縮小することにし、Ｆ２マウスでの解析匹数を増やすことに注力し研究の効率化をはかった。一方、遺伝的背景が全く不明であった高感受性系統Tg7について、全ゲノム関連解析を実施し、B10と129/Olaの混血であり、個体により混血の程度が異なることを解明した。さらに、Tg7マウスのゲノム上のトランスジーンが宿主の特性（ＣＥ高感受性という表現型）に影響を与えている原因である可能性もあるため、Tg7マウスの全ゲノムシークエンスを実施してトランスジーンの位置と配列を決定した。そこで、トランスジーンの影響について考察した結果、トランスジーンの影響とＣＥ高感受性を積極的に結びつける材料は見当たらないと結論した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定通り4世代目のマウスによるＣＥ感受性の判定を行い、その後の世代を作出する実験を繰り返して7世代目までコンジェニック化を継続するが、戻し交配に予想以上に時間・労力・費用がかかっているため、計画書に記載の通りにＦ２マウスでの解析匹数を増やしてSNPによる全ゲノム関連解析を行うことに注力し研究を効率的に進める。各群100匹分の全ゲノム関連解析で連鎖SNPが見つかれば、その結果をアレイを用いない手段で確認を行う。また、ゲノム標的領域の絞り込みが不十分であれば、予定通りにＦ２マウスで各群50匹程度の追加の全ゲノム関連解析を行う。それでもゲノム上の標的領域が上手く絞り込めない場合は、さらにＦ２マウスで各群50匹程度の追加解析を検討するか、あるいは他のSNPアレイ製品を用いた解析を検討する。どちらも上手く行かない場合は、SNPによる全ゲノム関連解析を中止し、効率は悪いものの7代目までのコンジェニック化に注力し、7世代目の高感受性マウスと低感受性マウスについて次世代シークエンサーを用いた全ゲノムシークエンス解析を実施し、両群で異なる遺伝子配列・構造を抽出してＣＥ感受性に関わる候補遺伝子群の同定に努める。それでも候補遺伝子群が同定できない場合には、全ゲノム関連解析結果を見直し、それぞれのデータセットについて並べ替え検定を行って閾値を設定し直し、閾値を超えるLOD値をもつ候補標的領域でターゲットシークエンス解析を行い、ＣＥ感受性に関わる候補遺伝子群を探す。また、次世代シークエンサーによる解析で候補遺伝子群を同定できない場合には、さらに個体数を増やして解析を行い、候補遺伝子群を絞り込む。
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