研究課題
1) マウス生体内神経細胞を標的としたRNA標識技術最適化の検討原生生物Toxoplasma gondii由来のUPRTをCre-loxP制御下で特定の神経細胞に誘導発現可能なUPRT Tgマウスと全神経細胞、小脳プルキンエ細胞でそれぞれCreリコンビナーゼを発現するNestin-Creマウス、Pcp2-Creマウスを交配し、組織特異的にUPRTを発現するマウスを樹立した。また、グリア細胞にCreリコンビナーゼを発現するGfap-Creマウスとも交配したマウスも樹立に成功した。その後、4-TUを腹腔内に投与する量、濃度、投与後に脳脊髄組織を回収するまでの時間などのパラメーターを振って、4-SUが最も効率的にRNAに取り込まれる条件を確立した。小脳であれば、２匹分で十分ラベルされたRNAが回収できることを確認した。脳全体やグリア細胞の場合であれば１匹分で十分量のRNAが回収でき、腹腔から投与した4-TUが脳血管関門を通過し、各種神経細胞中のRNAに取り込まれることが分かった。2) 各神経細胞の高精度RNA発現・RBP標的プロファイル作成と細胞種ごとの特徴付け神経細胞へのRNA標識法を確立した後、各神経細胞に由来するRNAを回収し、次世代シーケンサーで網羅的な解析を行う予定であった。すなわち、全神経細胞、全グリア細胞、小脳プルキンエ細胞に由来する標識RNAを十分量回収し、現在シーケンスを行っている。それぞれ２サンプルずるシーケンスしており、今後情報解析を行って、再現性を確認するとともに、各サンプルの性状を明らかにする予定である。
2: おおむね順調に進展している
研究開始当初予定していた通り、必要なモデル動物を樹立し、また4-TUを腹腔内投与した場合に脳神経細胞内のRNAがラベルされ、またこれを回収してシーケンスするに十分量が得られることが確認できた。現在、各神経細胞から回収したRNAをシーケンス解析中であり、おおむね順調に進展していると判断できる。
今後は、全神経細胞、全グリア細胞、小脳プルキンエ細胞に由来する標識RNAについてシーケンスの結果がで次第、対照と比較し、神経細胞やグリア細胞に特異的とされるRNA分子について明瞭な差異があるかどうかなどライブラリーの質の検討を行う。小脳プルキンエ細胞についてはPCP2遺伝子など特異性のある遺伝子群の発現量について解析する。その上で、小脳プルキンエ細胞に発現するRNAの特徴を明確にする。例えば、Ataxin-2遺伝子については、特異性はないものの高発現していることが予測される。また、非コードRNAを含め、特異的に発現するRNA分子の質と量や、週齢による差異について明らかにする。また、幾つかの候補を選択し、in situ hybridizationで結果の検証を行う。一方で、疾患モデルマウスを用いた変性神経細胞特異的に発現変動するRNA分子の特定を進める。特に小脳プルキンエ細胞の変性に伴うRNA発現変化を追うため、小脳変性の生じるモデル動物の作製に入る。このため、アデノウイルスベクターを使って変性を生じうる遺伝子を導入するためのコンストラクトを作製し、実際にマウスに導入することで疾患モデルとしての妥当性を検証し、発症時期などを明確にする。
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Cell Reports
巻: 17 ページ: 2004-2014
10.1016/j.celrep.2016.10.073.
http://www.med.osaka-u.ac.jp/pub/rna/publications.html
