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前年度までにマウス生体内神経細胞を標的としたRNA標識技術最適化を検討した。原生生物Toxoplasma gondii由来のUPRTをCre-loxP制御下で特定の神経細胞に誘導発現可能なUPRT Tgマウスと全神経細胞、小脳プルキンエ細胞でそれぞれCreリコンビナーゼを発現するNestin-Creマウス、Pcp2-Creマウスを交配し、組織特異的にUPRTを発現するマウスを樹立した。更にグリア細胞にCreリコンビナーゼを発現するGfap-Creマウスを樹立し、4-TUを腹腔内に投与する量、濃度、投与後に脳脊髄組織を回収するまでの時間などのパラメーターを振って、4-SUが最も効率的にRNAに取り込まれる条件を確立した。その後、標識した全神経細胞、全グリア細胞、小脳プルキンエ細胞に由来する標識RNAを次世代シーケンサーで網羅的な解析を行った。全神経細胞の場合には、特徴的なRNA発現プロファイルが得られることが分かった。一方、小脳プルキンエ細胞のように、標識する細胞の数が少ない場合には、非特異的に混入するRNAの影響を強く受けることも明らかとなった。このため、手法の改良が必要となり、今年度は4-SUを介したクロスリンク法を導入することで、特異的なRNAを識別する手法を検討した。様々な条件検討を行って、次世代シーケンサーで確認したところ、標識する細胞の数が少ない場合でも、標識したRNAだけを選択的に抽出できることが確認できた。現在、脊髄小脳変性症モデルとUPRT Tgマウスを交配し、神経変性の過程で変動するRNAを解析中である。
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