| 研究課題/領域番号 |
16H05339
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
金倉 譲 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20177489)
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| 研究分担者 |
横田 貴史 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60403200)
土居 由貴子 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (60722288)
織谷 健司 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (70324762)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 造血幹細胞 / クロマチン構造調節蛋白 / リンパ球分化 / 自己複製能力 / 多分化能力 |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子発現を包括的に調節するクロマチン構造制御蛋白Special AT-rich sequence binding protein-1(SATB1)の造血幹細胞における機能を解析した。血液細胞特異的にSATB1を欠損するマウスを、Tie2-Cre, Vav-Cre, Mx1-Creとの交配によって3系統樹立し、それらの成獣骨髄中の造血幹細胞の解析を行ったところ、すべての系統において造血幹細胞数が減少しており、かつ造血幹細胞のリンパ球への分化能力が顕著に障害されていた。移植実験の結果では、SATB1欠損造血幹細胞の造血再構築能力は低下しており、再構築された造血・免疫系はリンパ球が少なく、顆粒球造血への偏倚が観察された。
次にSATB1レポーターマウスを用いて、成獣骨髄の造血幹細胞分画の解析を行った。造血幹細胞分画はSATB1陰性～陽性の不均一な集団であり、SATB1陰性とSATB1陽性分画をソーティングし、in vitroでの機能解析を行ったところ、後者は高いリンパ球系への分化能力を持つ一方、赤芽球系への分化能力は著減していた。移植実験の結果では、SATB1陽性造血幹細胞はSATB1 陰性に比べて高いリンパ球産生能力と生着・造血再構築能力を示した。興味深いことに、2次移植を行った結果では元々のSATB1陰性とSATB1陽性造血幹細胞から同等の造血・免疫系の再構築が得られた。このことから、SATB1陰性とSATB1陽性の造血幹細胞は、長期的な自己複製の観点からは少なくとも部分的には相互転換することが示唆された。さらに単一の造血幹細胞を用いた移植実験においても、造血幹細胞のSATB1発現量の変動が観察された。以上の結果から、SATB1は造血幹細胞の自己複製とリンパ球系への分化能において重要な役割を果たしているとともに、造血幹細胞の質的なゆらぎをも制御している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の平成28・29年度の計画として、SATB1の血液系特異的なノックアウトマウスを作製し、造血幹細胞の機能解析を行う目標を立てていた。検討は順調に進み、Tie2-cre, Vav-cre, Mx1-Creの3系統のマウスでコンディショナルノックアウトマウスが作製でき、それぞれの系で移植実験を含めた造血幹細胞の機能解析まで進めることが出来た。またもう一つの計画としてSATB1の発現を生体内でモニタリングできる実験系を樹立し、造血幹細胞からの分化過程におけるSATB1の発現変化を生理的な状態で評価するという目標を立てていた。この目標においても、成獣マウス骨髄の造血幹細胞分画をSATB1の発現量に基づいて細分化し、機能解析を行うことができ、さらには単細胞の移植実験結果も得ることができた。以上の状況から、本研究は当初の計画通りに研究が進んでいると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究では、SATB1の生理的な機能をより詳細に解析するため、近年報告された生体内での目標蛋白質のビオチン化方法を応用して、SATB1蛋白のN末端にビオチン化領域とFlagタグ領域を付加したノックインマウスを用いて検討を行う。このマウスでは、ある特定のペプチド配列を選択的にビオチン化する大腸菌由来ビオチン化酵素BirAを過剰発現するマウスとの交配によって、研究対象のSATB1蛋白質が生体内において特異的にビオチン化される。既にマウスの作製は完了しており、研究にはいつでも着手できる状態である。
作製したビオチン化SATB1マウスから造血幹細胞を分離し、ストレプトアビジンビーズを用い、造血幹細胞の核内においてSATB1と結合している蛋白を同定する。また、抗SATB1抗体を用いた手法では極めて困難な高濃度SDSでの洗浄が可能となるため、夾雑物が少なく信頼性の高いchip-sequence assayを行える。その方法を用いて、造血幹細胞の全ゲノムでSATB1結合DNA配列を網羅的に解析する。次にビオチン化SATB1マウスとSATB1レポーターマウスの交配で得られた個体において、蛍光色素の強度に基づいて造血幹・前駆細胞を層別化し、それぞれの細胞集団におけるSATB1の共役蛋白や標的遺伝子を解析する計画である。
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