T-box遺伝子ファミリー機能解析による先天性心血管疾患発症機構の解明

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16H05359
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 山岸 敬幸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (40255500)
• 研究分担者: 土橋 隆俊 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (10286528) ; 内田 敬子 慶應義塾大学, 保健管理センター(日吉), 講師 (50286522) ; 家田 真樹 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (70296557) ; 湯浅 慎介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (90398628)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 発生・分化 / 遺伝子 / 循環器 / 発現制御 / シグナル伝達

研究実績の概要

交付申請書に記載した研究の目的に基づき、先天性心臓流出路異常モデル動物であるTbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子として葉酸の作用により心血管疾患の表現型が変化することを明らかにした。葉酸の作用機序および未知のepigenetic因子の特定を試みるため、正常餌および葉酸餌Tbx1発現低下マウス胎仔の遺伝子発現プロファイルを比較検討し、遺伝子pathwayに関わる上流CpG islandのDNAメチル化の変化を網羅的に解析した結果、Fibronectinをはじめとする胎生期の心臓発生に重要な役割を果たす複数の因子に有意な発現変化が認められた。Tbx1が機能する二次心臓領域細胞に対する上記因子の作用を検討するために、二次心臓領域由来の心臓前駆細胞を特異的に単離できるiPS細胞株をゲノム編集技術により樹立した。また、Tbx4の肺血管発生における機能解析について、Tbx4をノックダウン（KD）するRNAiを用いた実験、分子マーカーを用いた実験、血管新生・管腔形成能解析実験、ルシフェラーゼアッセイ、ChiPアッセイにより、Tbx4が下流の分泌性増殖因子であるFgf10の発現を直接調節することを証明し、Tbx4に制御される肺血管発生および肺動脈性肺高血圧に関与する新たな分子機序を解明した。Tbx20とTbx1による心疾患表現型の検討として、Tbx20のノックアウトマウスの作製に着手した。Tbx20の機能を喪失させるために変異を導入する部位を決定し、guide RNAをデザインして、CRISPR/Cas9システムを用いて変異を導入した。4系統の独立したマウスを得ることができ、いずれにも目的としたゲノム塩基配列に変異が導入されていることが確認された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

上記研究実績概要に記載した結果より、研究目的の1つであるTbx1とepigenetic因子による心疾患表現型の検討については、Tbx1発現低下マウスにおいて、環境・epigenetic因子の作用による心血管疾患の表現型の変化を詳細に解析・解明するシステムを確立することができ、葉酸の作用および心疾患表現型を変化させる複数の環境・epigenetic因子が特定された。その分子機構を解明するための実験の進捗状況は良好である。Tbx4とTbx1による肺血管発生および異常の検討については、培養細胞系を用いたTbx4の機能解析は良好に進捗し、1つの分子経路が解明された。Tbx4遺伝子改変マウスの利用について、進捗が遅れている。Tbx20とTbx1による心疾患表現型の検討については、Tbx1の心疾患表現型の詳細な解析は良好に進捗した。一方、Tbx20遺伝子改変マウスについては、当初既存の公表されたものを入手する計画だったが、困難だったため樹立に着手した。まだ解析には至っておらず進捗が遅れているが、4系統の変異マウスラインが樹立し、次年度には解析を完了できる見通しである。以上、一部計画の遅れがあるものの、全体的には概ね計画書に沿った進捗状況と考える。

今後の研究の推進方策

平成29年度に得られた成果をさらに発展させるために、今後、Tbx1の発現および心臓表現型を修飾するepigenetic因子の特定を試みる。平成29年度までに得られた結果で、発現量に有意な差（p<0.05）が生じた心臓もしくは神経堤細胞の発生に関与する因子につき、qRT-PCRで結果の再現性を確認する。同時にDNAを用いて、ターゲット因子のプロモーターに存在するCpGアイランドのメチル化を解析する。上記発現量・メチル化の有意差が検証された因子のRNAプローブを作製し、マウス胎仔を用いてWISHを行う。これらの検討により、心臓流出路発生における葉酸の作用するシグナルを特定する。また、Tbx4の肺血管発生に関する細胞培養系を用いた機能解析を通じて、Tbx4が肺間葉系細胞の増殖および肺血管への分化に関与することがわかってきた。肺間葉系組織特異的Tbx4変異マウスを作製してTbx4の肺血管発生における機能をin vivoで解析することを計画する。同時に、Tbx1とTbx4の遺伝子改変マウスを交配し、Tbx1/Tbx4ダブル変異マウスの肺血管表現型を解析する。さらに、Tbx1とT-boxファミリーの中で特に構造・起源が近いと考えられるTbx20との心臓発生および先天性心疾患発症における遺伝的相互作用について検討するために、平成29年度までに樹立したTbx20変異マウスとTbx1発現低下マウスを交配し、Tbx20/Tbx1複合遺伝子変異マウスを作製する。詳細な心臓血管表現型を詳細に解析し、Tbx20とTbx1の遺伝子異常の組合せ（多因子変異）による心血管疾患の発症機序を明らかにする。

研究成果

• [国際共同研究] Gladstone Institute/Feinberg Institute(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Gladstone Institute/Feinberg Institute
• [雑誌論文] Direct In Vivo Reprogramming with Sendai Virus Vectors Improves Cardiac Function after Myocardial Infarction. (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto K, Akiyama M, Tamura F, Isomi M, Yamakawa H, Sadahiro T, Muraoka N, Kojima H, Haginiwa S, Kurotsu S, Tani H, Wang L, Qian L, Inoue M, Ide Y, Kurokawa J, Yamamoto T, Seki T, Aeba R, Yamagishi H, Fukuda K, Ieda M.
  • 雑誌名: Cell Stem Cell. 巻: 22 ページ: 91-103
  • DOI: doi: 10.1016/j.stem.2017.11.010.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Association of Severity of Coronary Artery Aneurysms in Patients With Kawasaki Disease and Risk of Later Coronary Events. (2018)
  • 著者名/発表者名: Miura M, Kobayashi T, Kaneko T, Ayusawa M, Fukazawa R, Fukushima N, Fuse S, Hamaoka K, Hirono K, Kato T, Mitani Y, Sato S, Shimoyama S, Shiono J, Suda K, Suzuki H, Maeda J, Waki K; and The Z-score Project 2nd Stage Study Group, Kato H, Saji T, Yamagishi H, et al.
  • 雑誌名: JAMA Pediatr. 巻: 5 ページ: e180030
  • DOI: doi: 10.1001/jamapediatrics.2018.0030.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 【二次性心筋症へのトータルアプローチ】 ライソゾーム病による心筋症 (2018)
  • 著者名/発表者名: 荒木 耕生, 安原 潤, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 心エコー 巻: 19 ページ: 166-172
• [雑誌論文] 【胎児心臓をみる-診断から治療へ】 先天性心疾患の発生学 (2018)
  • 著者名/発表者名: 古道 一樹, 吉田 祐, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 産科と婦人科 巻: 85 ページ: 12-19
• [雑誌論文] Regulation of Sema3c and the Interaction between Cardiac Neural Crest and Second Heart Field during Outflow Tract Development. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kodo K, Shibata S, Miyagawa-Tomita S, Ong SG, Takahashi H, Kume T, Okano H, Matsuoka R, Yamagishi H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 7 ページ: 6771-
  • DOI: doi: 10.1038/s41598-017-06964-9.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Current Insights into Genetics of Congenital Heart Diseases: GATA and T-box Cardiac Transcription Factors as the Hotspot Pathogenesis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kodo K, Yamagishi H
  • 雑誌名: Journal of Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery 巻: 1 ページ: 18-27
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 【心臓の発生・再生・創生】心臓形成からみた病態の理解 先天性心疾患 流出路の形態形成からみる疾患の理解 (2017)
  • 著者名/発表者名: 古道 一樹, 吉田 祐, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 生体の科学 巻: 68 ページ: 554-558
• [雑誌論文] 【小児科エコー活用術】 心臓 心臓の解剖と心臓構造異常のエコー 上級編 (2017)
  • 著者名/発表者名: 前田 潤, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 小児科診療 巻: 80 ページ: 1435-1443
• [雑誌論文] 【小児科エコー活用術】 心臓 心臓の解剖と心臓構造異常のエコー 初級編 (2017)
  • 著者名/発表者名: 安原 潤, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 小児科診療 巻: 80 ページ: 1429-1434
• [雑誌論文] 【小児科ケースカンファレンス】 循環器疾患 チアノーゼ性先天性心疾患(完全大血管転位) (2017)
  • 著者名/発表者名: 安原 潤, 山岸 敬幸
  • 雑誌名: 小児科診療 巻: 80 ページ: S240-S244
• [学会発表] わかる！ 臨床心臓発生学 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山岸敬幸
  • 学会等名: 第20回成人先天性心疾患学会
  • 招待講演
• [学会発表] 胎児心エコースクリーニングのための臨床心臓発生学 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山岸敬幸
  • 学会等名: 第24回胎児心臓病学会
  • 招待講演
• [学会発表] 小児循環器診療に役立つ遺伝子疫学 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山岸敬幸
  • 学会等名: 第53回三重小児循環器談話会
  • 招待講演
• [学会発表] ここまで知っておきたい発生学 左右軸の決定と内臓錯位症候群 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山岸敬幸
  • 学会等名: 第53回日本小児循環器学会
  • 招待講演
• [学会発表] 小児循環器physician-scientistによる 心臓発生研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山岸敬幸
  • 学会等名: 第11回北大阪先天性心疾患フォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] RS virus infection in children with heart and lung diseases (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamagishi H
  • 学会等名: The 8th Takao International Symposium on Molecular Mechanism of Cardiopulmonary Diseases
  • 招待講演