| 研究課題/領域番号 |
16H05364
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
八田 稔久 金沢医科大学, 医学部, 教授 (20238025)
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| 研究分担者 |
東海林 博樹 金沢医科大学, 一般教育機構, 教授 (10263873)
坂田 ひろみ 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (50294666)
島田 ひろき 金沢医科大学, 看護学部, 准教授 (60278108)
有川 智博 金沢医科大学, 一般教育機構, 准教授 (70452670)
塚田 剛史 金沢医科大学, 医学部, 助教 (90647108)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 白血病抑制因子 / 胎盤 / 副腎皮質刺激ホルモン / インターニューロン / インターロイキン６ |
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| 研究実績の概要 |
我々は母-胎児間leukemia inhibitory factor (母胎間LIF)シグナルリレーによる胎児の発生調節機構を初めて同定した(Simamura et al., 2010)。母体免疫亢進状態では児が自閉症様行動を呈することが知られており、大脳インターニューロンの産生・分化障害が示唆されているが、その病態成立機序に関しては、一定の見解が得られていない。本研究では、母胎間LIFシグナルリレーの胎児大脳インターニューロン産生誘導における役割を解明するとともに、自閉症の素因形成メカニズムの一端を明らかにすることを目的とする。
前年度までに行ったマウス胎児大脳のDNAマイクロアレイ解析にて見出していた母胎LIF投与に反応して発現亢進する遺伝子群のうち、インターニューロンの分化誘導に関連することが知られる遺伝子の発現を定量的PCRで再確認した。また、妊娠13日のC57/BL6マウス胎児大脳由来の神経幹細胞から作製したニューロスフェアを用いてLIF反応性を解析したところ、背側大脳由来と、腹側大脳由来のニューロスフェアでは、LIF刺激に対するGABAニューロン関連遺伝子群の発現が異なることが判明した。また、これらの上流に位置すると考えられるマスター遺伝子の候補を見出すことができた。この上流遺伝子は、インターニューロン関連遺伝子の発現誘導をかけることが報告されているが、それ自体の発現を誘導するメカニズムに関しては報告がなかった。本年度の研究によって、インターニューロン誘導のマスター遺伝子の発現が、母胎間LIFシグナルリレーにより調節されている可能性が示唆された。
また、GAABAニューロン局在の全脳解析のハイスループット化のために用いる新たな組織透明化プロトコルが完成し、特許申請準備中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
妊娠マウス母体へLIFを投与した後、胎児大脳における遺伝子発現をDNAマイクロアレイにより解析した。その結果、発現亢進した神経関連遺伝子のうち上位20遺伝子の約半数が、インターニューロンの産生・分化誘導関連の遺伝子であった。変動が認められた遺伝子については、定量的RT-PCRを用いて個別に遺伝子の発現を確認した。また、ニューロスフェアを用いて培養系でも検証を行い、同様の結果が得られている。
大脳におけるインターニューロンの総数を推定するために、50μm程度の、厚切り完全連続切片作製法の開発を行ってきた。前年度までに確立したアクリルアミド包埋法の有用性を検証したところ、切片が変形しやすいこと、免疫染色が可能なのは切片表層のみであることなどから、本研究の目的には不向きであることが分かった。従来、厚い切片の作製にはセロイジンが常用されてきたが、製造は長らく中止されたままであり、代替品も開発されていない。そこで、セロイジンと同様に硝化綿を主原料とするコロジオンを用いた新しい切片作製法について検討を行った。また、コロジオン切片をスライドガラスに張り付けるための専用スライドガラスコーティング剤の開発を行った。その結果、マウス脳の完全厚切り切片をコンスタントに作製し、スライドガラス貼付・染色することが可能なプロトコルを完成することができた。さらに、高濃度のエタノール中でコロジオンが容易に溶解することを見出し、切片の脱コロジオン操作、その後の免疫染色への応用の可能性が開かれた。これは、従来のセロイジンでは不可能な特性であり、コロジオン切片法の画期的な利点である。新規開発したコロジオン切片作製法を前年度までに確立した組織透明化プロトコルと組み合わせ、ハイスループット全脳組織解析を行う準備が整った。
以上のごとく、研究進捗状況はおおむね順調と評価できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度は、ニューロスフェアの培養実験で確認された結果について、マウス胎児を用いてin vivo実験系で確認する。中和抗体や関連シグナルの阻害剤等を用いた機能阻害実験も行う。また、この研究成果は、対象領域を中脳にすることで、中脳腹側からのドーパミンニューロン産生を誘導できる可能性が高いため、これについても検討を行う。
さらに、母胎間LIFシグナル破綻モデルをGABAニューロンをGFP標識したトランスジェニックマウスに適用し、母体免疫亢進により惹起される母胎間LIFシグナルリレーの断絶モデルにおける、胎児GABAニューロン産生状況を脳全域にわたって検索する。これに用いるGAD-EGFPマウスの受精卵導入はすでに済んでおり、早急に、マウスコロニーを確立し、解析を開始する。
そのために、ハイスループット画像解析取得装置（CV7000、横河電機）と新規組織透明化プロトコルにより構築されるユニークな解析システムを用いて、胎児および新生児脳の高速・高解像度かつ網羅的な組織解析法の確立を目指す。
最終年度は、北米神経科学会にて研究成果をポスター発表するとともに、国際誌に論文を投稿する。
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