| 研究課題/領域番号 |
16H05438
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
野村 貞宏 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (20343296)
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| 研究分担者 |
柴崎 貢志 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (20399554)
美津島 大 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70264603)
富永 真琴 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (90260041)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 温度生物学 / てんかん / TRP / 局所脳冷却 / Neuromodulation |
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| 研究実績の概要 |
脳温による脳損傷の差をマウスの頭部外傷モデルで調べた。脳表をペルチェ装置で25、30、35、37、40℃で3時間冷却または加温し1週間後に脳挫傷体積を測定した。挫傷サイズは温度依存性に増大し、25℃と40℃、30℃と40℃の間でそれぞれ有意差が認められた。Microgliaの活性化率は40℃＞35℃＞30℃の順であった。脳冷却が脳保護効果を示すことが、頭部外傷モデルで再現された。
TRPKOマウスでの脳損傷縮小効果をWild typeマウスおよび2種のTRPノックアウトマウス(TRPM2 KO、TRPV4 KO)で調べた。頭部外傷モデルを作成し脳表温度は35℃にした。1週間後に固定し脳挫傷体積を測定した。脳挫傷領域はTRPM2 KOマウス、TRPV4 KOマウスともwild typeマウスよりも有意に小さい体積を示した。TRPM2、TRPV4の作動温度はそれぞれ33－48℃、30－47℃であり、その温度帯でCa2+が細胞内に流入し、神経活動が亢進する。従ってこれらのKOマウスは脳温度が33℃以下、30℃以下に調節されたWild type マウスに相当する。両KOマウスにおいて脳保護効果が見られたことは、TRPM2、TRPV4の阻害剤が脳冷却療法の代替療法になる可能性が示唆された。
脳切片を用いて神経細胞活動電位の温度による変化を調べた。てんかん2症例の側頭葉皮質から標本を摘出し神経細胞の静止膜電位と脱分極頻度を測定した。測定中、チャンバー温度を25℃、15℃、25℃と変化させた。25℃でのヒト神経細胞の静止膜電位は-75.0～-67.5mVであった。15℃で静止膜電位は-60.0～-56.0mVとなり、より脱分極しやすい状態に変化した。最大脱分極回数は冷却前の平均5.5回から冷却中は1.0回に減少した。冷却によって神経細胞の脱分極頻度が減少することが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脳温による脳損傷の差をマウスの頭部外傷モデルで調べることができ、脳冷却が脳保護効果を示すことが、頭部外傷モデルで再現された。効果は温度依存性であり、30℃以下では効果がプラトーになる可能性が示唆された。効果に変曲点があることは、TRPの影響があることを示唆する好ましい初見と考えている。同様にTRPKOマウスでの脳損傷縮小効果をWild typeマウスおよび2種のTRPノックアウトマウス(TRPM2 KO、TRPV4 KO)で調べることができた。脳挫傷領域はTRPM2 KOマウス、TRPV4 KOマウスともwild typeマウスよりも有意に小さい体積を示したことからTRPM2、TRPV4の阻害剤が脳冷却療法の代替療法になる可能性が示唆された。
脳切片を用いて神経細胞活動電位の温度による変化を、てんかん2症例の側頭葉皮質から標本を摘出し調べることができた。神経細胞の静止膜電位と脱分極頻度が測定でき、冷却によって神経細胞の脱分極頻度が減少することが確認された。
以上は当初の計画と一部異なる点もあるが、おおむね順調と考えられる結果である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの検討で絞り込まれたTRP分子（TRPM2, TRPV4）をvitroの再現系でさらに評価する。TRP分子群がいずれの細胞種（神経細胞、グリア細胞、血管内皮細胞等）に発現するか初代培養系で検討する。
TRPの感受性閾値shiftを検討するために、摘出脳スライス（難治性てんかん治療のため、および重症頭部外傷と脳卒中患者救命治療のために摘出した大脳皮質・海馬）と単離細胞を用い、パッチクランプ法で電流活性化温度閾値を決定する。てんかんや熱性けいれんではTRPV1のように通常43度以上の高温域で活性化するチャネルがより低温域へ閾値がshiftする。同様の可能性がTRPM2, TRPV4にもあると考えられるので、体温よりさらに冷却してTRPチャネルを抑制することがてんかん治療・予防となるか理論的根拠を明確にする。
TRP活性化に対するneurotransmitterの関与を検討する。脳スライス或いは神経細胞培養液にTRPチャネル作動薬を加えてCa2+イメージング法により細胞内Ca2+濃度変化を解析する。この際、神経伝達物質のglutamate(興奮性)/GABA(抑制性)添加による細胞内Ca2+濃度変化閾値のshiftを観察して、脳活動や熱性けいれんがてんかんに及ぼす影響をTRPチャネルからとらえる。
microgliaにおけるTRPチャネルの作用を調べる。microgliaは脳炎を増悪している可能性がある。マウス脳からmicrogliaを分離し、37℃と42℃で培養し、microgliaの産生するTNF-α、IL-10、NOを測定する。TRPM2作動薬・拮抗薬の有無、およびTRPM2 KOマウスmicrogliaでのデータを比較し、脳炎に対するTRP拮抗創薬の基礎を作る。
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