| 研究課題/領域番号 |
16H05442
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
永根 基雄 杏林大学, 医学部, 教授 (60327468)
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| 研究分担者 |
市村 幸一 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (40231146)
富山 新太 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 病院 脳神経外科, 講師 (40385810)
中村 大志 横浜市立大学, 医学部, 助教 (60771615)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 中枢神経系悪性リンパ腫 / PIM1 / BAD / 部位特異的変異導入法 / シグナル伝達 / 転移機序 |
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| 研究実績の概要 |
我々のグループの先行研究で報告した、中枢神経系に原発する悪性リンパ腫(Primary Central Nervous System Lymphoma; PCNSL)において、全身性悪性リンパ腫と比較して高頻度の変異が認められた遺伝子のうち、特にPCNSLで高頻度 (全身性悪性リンパ腫で10-30%の頻度であるのに対しPCNSLで100%)であった癌原遺伝子PIM1の変異がPCNSLの腫瘍原性においてどのような役割を果たしているのかを解明し、未だ有効な治療法の存在しないPCNSLに対するな新規分子標的治療法を開発する事を目標として研究を開始した。2016年（初年度）は、まず臨床で特に繰り返し高頻度に認められたPIM1遺伝子変異の機能解析を開始し、それらのうち、一部については活性型変異である可能性が示唆された。現在、これらの活性型変異が疑われたPIM1変異につき更なる機能解析ならびに発がんメカニズムへの関与についての検討を進めており、in-vivo実験に向けての準備も行っている。
PCNSLに対する治療開発の観点から、PCNSLの殆どがdiffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)であることから、全身性DLBCLにおける細胞内シグナル伝達経路で重要とされるB cell receptor (BCR)およびToll-like receptor (TLR)からNF-kBを活性化する増殖亢進シグナルに関する検討を準備している。
PCNSLの発生起源及び転移メカニズムを解明する目的で、PCNSLの全身転移または全身DLBCLからの脳転移患者において、脳内及び他臓器における腫瘍標本の収集を準備している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PIM1遺伝子変異の腫瘍原性について評価するため、まず、特に臨床サンプルで高頻度に繰り返し認められたPIM変異体cDNAを、PIM1 (short form)を用いて作製し、それぞれHek293T細胞およびヒト神経膠芽腫細胞株であるT98G細胞に導入して、各PIM-1変異体の発現量をウエスタンブロットで解析した。また、シグナル下流の評価として既知のPIM-1の基質であるBAD (Bcl-2 associated death promoter) のPIM-1によるリン酸化を評価するため、BAD内在性発現が確認されたヒト神経芽細胞腫細胞株であるNagai細胞に野生型および変異体PIM1を導入し、ウエスタンブロットで評価した。その結果、特にK115N変異体を導入した細胞では、野生型と比較してPIM-1発現の上昇とシグナル下流のBADのリン酸化の亢進が認められた。また、K115N変異が細胞死誘導にもたらす影響を検討するために、GFP-タグ付き野生型PIM1およびK115N変異体をそれぞれNagai細胞に導入し、血清除去下でのカンプトテシン処理による細胞死誘導を、GFP陽性細胞の死細胞染色で評価を行ったところ、PIM1野生型と比較してK115N変異体発現細胞では細胞死誘導の抑制が認められた。
また、PIM1野生型およびK115N変異体におけるPIM-1の分解速度の差を評価するため、PIM1野生型ならびにK115N変異体を導入したT98G細胞でシクロヘキシミド追跡実験を行ったところ、K115N変異体で野生型と比較してPIM-1分解の遅延が認められた。更に、K115N変異体では野生型と比較してPP2A (Protein phosphatase 2A)との結合が低下していることが免疫沈降法で明らかになったことから、PP2AがPIM-1の分解遅延に関わっている可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度で未検討のPIM1 (long form)での臨床で高頻度に繰り返し認められた各PIM1変異体の作成を行い、前年度のshort formと同様に活性型変異かどうかの検討を行う。それと並行して、前年度に引き続き、K115N変異体におけるPIM-1分解遅延がPP2Aとの結合に依存しているかどうかを更に評価するために、PP2A阻害剤や PP2AのsiRNAによるノックダウンを用いて、シクロヘキシミド追跡実験や免疫沈降法等で検証する。また、PIM1変異体による細胞死の抑制がBADないしはBADのリン酸化に依存しているものかどうかを、野生型PIM1ならびにK115N変異体を導入した細胞株で、BADのsiRNAによるノックダウン、BADの細胞死誘導に対する優勢変異体の導入、もしくはPIM阻害剤を用いた検討等で行う予定である。
更に、ヒトDiffuse Large B cell lymphoma培養細胞株もしくはヒトPCNSL培養細胞株に対して各PIM1変異体 (short form, long form) の導入を行い、一連の実験結果が再現可能かどうか検証する。また、必要に応じて、血球系細胞でも遺伝子導入が容易であるウイルスベクターを使用しての遺伝子導入に変更するため、各PIM1変異体のウイルスベクターへのクローニングを行う。
更に、K115N変異における細胞死抑制効果がin vivoの実験でもみられるか、野生型PIM1およびK115N変異体を安定導入した各細胞を用いて、免疫不全マウスでの皮下腫瘍モデルもしくは腹腔内/静脈内播種による全身腫瘍モデルの作成し、抗腫瘍薬のマウスへの全身投与にて効果判定を行う。
前年度に準備を進めているPCNSL/DLBCL細胞株からBCRシグナル・NFkBの活性化・阻害を試みる。
脳内及び他臓器のペア腫瘍標本から遺伝子解析を行い、転移機序を検討する。
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