| 研究課題/領域番号 |
16H05445
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
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| 研究分担者 |
鈴木 洋史 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (80206523)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / 骨代謝 / 発生・分化 / Wnt / Frizzled / RANKL |
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| 研究実績の概要 |
RANKL逆シグナル経路は、Runx2の活性化をトリガーすることで骨芽細胞の初期分化を加速し、カップリングを媒介するシグナル機構の一部を構成する可能性を、申請者らが新規に見出した。一方、Wntシグナル経路は骨芽細胞の分化過程における重要性が示唆されているものの、Wnt分子およびFzd分子の多様性も相俟って、その全体像は未だ明らかとはなっていない。そこで本研究においては、生理的な骨芽細胞分化の各段階において、骨芽細胞の分化制御に特に関与するWnt-Fzdの組み合わせを、網羅的なアッセイを行って同定し、その後、RANKL逆シグナルとどのようにクロストークして、骨芽細胞の分化過程全体を制御しているのか、その全体像の解明を目標としている。
平成２９年度はまず、前年度に行った網羅的なシグナル経路の活性化パターンの解析に基づいて検討を進めた。その結果、骨芽細胞分化に影響を与えるシグナル経路に関する解析を進め、骨芽細胞の初期分化過程においては、βカテニン経路の活性化が主要な役割を果たすことが示唆され、逆に骨芽細胞の後期分化過程においてはPCP経路の活性化が主要な役割を果たすことが示唆された。一方で、遺伝子導入に汎用されるCMVプロモータに関して、Wntシグナル経路の活性化パターンに依存して、大幅に転写活性に影響が生じることが明らかになったため、より正確な評価結果を得るため、各Wnt関連遺伝子の発現プロモータを影響の少ないプロモータを、スクリーニングによって同定し、関連する全てのアデノウィルスを再構築した。さらに、全ての組み合わせに関してシグナル経路の活性化プロファイルの再取得を完了した。今後、新規のプロファイルの結果も踏まえて、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を実施していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
骨芽細胞の初期分化過程を主にβカテニン経路の活性化が、後期分化過程を主にPCP経路の活性化が制御していることが示唆され、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を行うための基盤が得られたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度から行なっている、RANKL逆シグナル経路の活性化を考慮に入れて抽出した、骨芽細胞の分化に主要な役割を果たすWnt-Fzdの組み合わせに関して、mRNA発現を抑制するshRNAをデザインし、アデノウィルスベクターを構築する。次いで、骨芽細胞の各分化段階にある細胞に大して、上述のWntあるいはFzdに対する遺伝子発現の抑制を行って、Wntシグナル経路を遮断し、同時に抗RANKL抗体による刺激を行ってRANKL逆シグナル経路を活性化した場合、骨芽細胞の分化成熟にどのような影響が生じるかを検証する。また、特定の組み合わせでWntあるいはFzdを過剰発現させた状態で、RANKL逆シグナルが活性化された場合の影響に関しても、同様に検証を進める。並行して、特定のWntシグナル経路を遮断した影響を、生体レベルで検証するため、選択されたWnt分子に対する中和抗体の作出を行い、CHO-DG44細胞をホストとして用いたIR/MAR遺伝子増幅手法を用いて、高発現株の樹立と組み換え抗体の取得を行う。
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