| 研究課題/領域番号 |
16H05456
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
酒井 大輔 東海大学, 医学部, 准教授 (10408007)
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| 研究分担者 |
檜山 明彦 東海大学, 医学部, 講師 (00514382)
升井 伸治 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点講師 (20342850)
平山 令明 東海大学, 先進生命科学研究所, 教授 (70238393)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 椎間板 / 再生医療 / iPS技術 |
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| 研究実績の概要 |
本研究計画の目的は、椎間板髄核細胞の分化、生存を制御する転写因子ネットワークについてiPS技術を用いて解析し、未だ詳細には解明されていない、iPS細胞や間葉系幹細胞などからの椎間板髄核前駆細胞の誘導法を確立することである。その後、明らかとなったコア転写因子を用いて、髄核細胞の機能向上、コア転写因子を標的とした新規治療法の開発など椎間板再生医療研究に広く応用することである。
実験１椎間板髄核細胞のiPS化：コア転写因子を同定するiPS干渉法を行うために、椎間板髄核細胞のiPS化を行った。京都大学iPS研究所のiPS化プロトコールに従いiPS細胞評価は細胞形態変化とアルカリフォスファターゼ染色にて行った。その結果、椎間板髄核細胞のiPS化が認められたが、酸素分圧の調整など検討材料が得られた。
実験２椎間板髄核細胞iPS化の高効率化、遺伝子導入効率の向上：椎間板髄核細胞はiPS化したものの導出効率が低く、iPS干渉法で阻害度を測定するには不十分であったため、iPS化の高効率化を行った。GFPにて遺伝子導入効率が良い酸素分圧、培養条件を検討した。その結果、低酸素＋α-MEM培地の条件にて高いGFP発現率（80％）を認め、常酸素＋D-MEM培地の条件では発現率は低かった（46.2％）。
そこで酸素分圧と、細胞密度を振ってiPS化工程を行った結果、全工程を低酸素条件でした群ではiPS化は起こらなかった。遺伝子導入時は低酸素条件で行い、その後は常酸素条件に戻した群で多数のiPSコロニーを認めた。これは一般的に線維芽細胞のiPS化では低酸素にてiPSコロニー数は増加することが知られているが、低酸素、HIF1A、HIF2Aは髄核細胞の特性としても非常に重要であることが知られているため、低酸素条件が髄核細胞形質を維持させたことが考えられ、新たな知見を見出した。
現在、転写因子の絞り込みを行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
iPS技術を用いた髄核細胞の導出に向け、転写因子の絞り込み作業は最終６個まで進んでいる。さらに特許申請も１カ月内に済ませる状況にある。次年度は転写因子導入によるDirect reprogrammingの確認、in vivoでの評価を行う。進捗は円滑に推移しており、目標鉄製は可能と考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は転写因子導入によるDirect reprogrammingの確認、in vivoでの評価を行う。
まず、髄核特異性を制御している転写因子らを約10個を用いて、ヒトiPS細胞もしくはヒト線維芽細胞から髄核様細胞を導出する。
予想される結果：PITX1、PAX1、BRACYURYなど1-3個の転写因子の導入で髄核様細胞が導出される。導出細胞の細胞機能、細胞特性が不十分の場合は、今までの転写因子解析の結果から次点の転写因子も組み合わせコア転写因子ネットワークの同定を行う。また、PITX1やPAX1のChIP-sequenceを行いゲノム上での結合部位をゲノムワイドかつ網羅的に解析する。
次に導出した髄核様細胞をSdヘテロ欠損マウスの椎間板内に移植しその治療効果を評価する。
予想される結果：導出髄核様細胞移植で、変性処置群と線維芽細胞移植群と比較して治療効果が得られる。結果が明らかではなかった場合、マウスiPS細胞から誘導した中内胚様系幹細胞にコア転写因子を導入したものをSdヘテロ欠損マウス胚へ移植する方針とする。
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