研究課題
難聴の原因は、内耳有毛細胞の損傷・消失とされている。本研究計画では、多能性幹細胞であるES細胞などを用いて有毛細胞を創生し、内耳性難聴治療の基礎的研究を目的とした。初年度（平成２８年度）は、有毛細胞の発生や分化に関わるマスター遺伝子Math1に着目し、Math1の発現に連動して蛍光タンパク質（GFP）が発現可能なES細胞の樹立（Math1-GFP ES細胞）を試み、それらの細胞を解析した。Math1-GFP ES細胞の樹立には、Math1プロモーターとのGFP遺伝子の配列をサブクローニングし、連結させた遺伝子コンストラクトを作製した。親株（EB5）に遺伝子導入後、薬剤セレクションによって耐性株を選定し、未分化性が維持されているES細胞株を樹立することに成功した。さらに、Math1をTet-Onシステムにより発現制御可能なES細胞（Tet-Math1 ES細胞）を用いて、我々が開発した分化誘導法（HIST2法）（Ouji et.al., Cell Death Dis., 2012）と組み合せ、有毛細胞への分化誘導を試みた。その結果、有毛細胞の分化誘導効率は亢進した。これらの成績より、ES細胞から有毛細胞を作成する際に、Math1遺伝子の重要性を検証することができた。次年度（平成２９年度）、本年度までに樹立した細胞株を活用して、有毛細胞への更なる効率的分化誘導法を検討し、多能性幹細胞より創出する有毛細胞の細胞生物学的、分子生物学的解析を行う。
2: おおむね順調に進展している
研究計画に基づき、期待した実験成果が得られており、学会発表および論文発表での成果報告を行っているため。
本研究では、前述した目的を達成するために、次年度（平成２９年度）、有毛細胞への更なる効率的分化誘導法の確立を目標に、以下の項目を実施する。○Math1-GFP ES細胞を用いて有毛細胞の効率的分化誘導法を開発する。具体的にはMath1-GFP ES細胞を用いて、培養液、添加因子、共培養あるいは培養環境を組み合わせることで最適条件を検討し、最も効率の良い分化誘導条件を探る。また、共培養の際には、種々の細胞株以外に、耳発生段階初期の細胞を採取後、株化した細胞も用いる予定である。○最適条件下で分化誘導した有毛細胞様細胞の詳細な解析を行う。分化誘導後、有毛細胞特異的抗原を免疫染色、あるいはリアルタイムRT-PCRにより精査し、タンパクレベル、遺伝子レベルでの発現を解析する。また、電子顕微鏡観察により、微細構造を観察、確認することで、細胞構造学的解析を行う。さらに、電気生理学的な解析を用いて、機能的有毛細胞への分化誘導に成功しているかを確認する。以上の検討により、多能性幹細胞から有毛細胞への分化誘導法を確立し、次年度以降の細胞移植による内耳性難聴治療の基礎的検討を進めてゆく。また、進捗状況により、分化誘導法の成績を取りまとめ、それらの成果を発表することもあり得る。
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