研究課題
難聴の原因は、内耳有毛細胞の損傷・消失とされている。本研究計画では、多能性幹細胞であるES細胞などを用いて有毛細胞を創生し、内耳性難聴治療の基礎的研究を目的とした。本年度（平成29年度）は、有毛細胞への効率的分化誘導法の確立とその特性解析を目標に、以下の項目を実施した。○有毛細胞の発生・分化の鍵となる転写因子Math1の発現と連動してGFPを発現するES細胞株（Math1-GFP ES細胞）を用いて、有毛細胞への効率的分化誘導法をスクリーニングした。培養液、添加因子、共培養あるいは培養環境を組み合わせることで最適条件を検討し、最も効率的な分化誘導条件を見出した。共培養系と組み合わせることにより、飛躍的に誘導効率が亢進され、フローサイトメトリーの成績からも、個々の細胞の分化誘導が亢進していることが実証できた。本年度に、これらの成績を取りまとめ、学会発表を行った。○最適条件下で分化誘導した有毛細胞様細胞の詳細な解析を行った。分化誘導後、有毛細胞特異的な抗原を免疫染色、あるいはリアルタイムRT-PCRにより精査し、タンパクレベル、遺伝子レベルでの発現を解析した。現在、本内容に関する論文を作成中である。以上の検討により、多能性幹細胞から有毛細胞への分化誘導法を確立し、次年度以降の細胞移植による内耳性難聴治療の基礎的検討を進めてゆく。
2: おおむね順調に進展している
研究計画に基づき、順調に実験成果が得られており、学会発表および論文発表での成果報告を行っているため。
次年度（平成30年度）の研究計画として、以下の項目を検討する。〇前年度（平成29年度）に行った分化誘導条件を更に細かく検討する。現在までに得られている最適条件を用いた至適条件の再現性を確認しつつ、更に培養環境の最適条件をスクリーニングすることで、より効率の良い分化誘導法を見出す。有毛細胞特異的な抗原を免疫染色、あるいはリアルタイムRT-PCRにより解析し、電子顕微鏡による微細構造解析や電気生理学的解析を行うことで、機能性を保有した有毛細胞に分化誘導されているかを検証する。〇高効率に分化誘導した多能性幹細胞由来有毛細胞を、マウスより単離する蝸牛に移植し、一定期間培養した後、種々の解析を行う。具体的には、多能性幹細胞を蛍光試薬で標識化することで、移植後の細胞を追跡する。培養蝸牛内に生着した細胞の生着環境を共焦点レーザー顕微鏡などにより立体映像化し、ホスト細胞とのコンタクト（聴神経細胞などとの連携）を解析することで、移植後の細胞動態を解析する。また、電気生理学的解析により、機能的有毛細胞として働き得るかを検証する。以上の検討により、多能性幹細胞から分化誘導した有毛細胞を用いて細胞移植による内耳性難聴治療の可能性を見出し、最終的に、実験動物モデルによる内耳性難聴治療の基礎的検討を進めてゆく。また、分化誘導の成績を取りまとめた内容や、培養蝸牛移植モデルを用いた研究成果をとりまとめ、逐次、学会、論文発表する予定である。
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