| 研究課題/領域番号 |
16H05485
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| 研究機関 | 岩手大学 |
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研究代表者 |
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
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| 研究分担者 |
片山 統裕 東北大学, 情報科学研究科, 准教授 (20282030)
福田 智一 岩手大学, 理工学部, 教授 (40321640)
菅野 江里子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (70375210)
田端 希多子 岩手大学, 理工学部, 学術研究員 (80714576)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 眼生理学 / 遺伝子治療 |
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| 研究実績の概要 |
ChR2（青感受性のチャネルロドプシン）を恒常的に発現するトランスジェニックラット（ChR2-TG)の網膜に、当研究室で開発した可視光感受性のチャネルロドプシン遺伝子(mVChR1)をアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いて遺伝子導入を行った。これにより、青感受性遺伝子と可視光感受性遺伝子の両方が網膜細胞に発現するラットを作製した。また、このラットは正常な視細胞を持つため、N-methyl nitorosourea（MNU）を腹腔内投与し、生来ラットが持つ視細胞を変性させ、電気生理学的に両チャネルロドプシンが作り出す視機能を調べた。
MNU投与により網膜電図はいずれの動物においても記録されず、また、光干渉断層計においても視細胞層は観察されず、生来の視細胞が消失していることが示された。一方、視覚誘発電位測定では、ChR2-TGラットは青色光、mVChR1およびmVChR1-ChR2-TGラットは青、緑、赤色光に応答を示し、mVChR1の遺伝子導入によりChR2-TGの感受波長域が増大した。これらの結果から、異なる機能を持つチャネルロドプシンを追加投与することにより、さらに視機能を高めることができることが示唆された。しかしながら、感受波長域の増大が見られたものの、視覚誘発電位の振幅はChR2のみと、両方を発現するラットでは有意な差は認められず、２つの遺伝子が発現しても反応性は増大しないことが明らかとなった。さらに、各遺伝子を発現する神経節細胞数を調べたところ、ChR2-TGでは63.1％、mVChR1は16.7％、両方を発現する細胞は11.7％であり、AAV-mVChR1の投与により、mVChR1発現細胞のほとんどがChR2を発現する細胞であることが判明した。
以上の結果から、今後、ChR2発現細胞以外にmVChR1遺伝子を導入する手法を開発する必要があると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年9月、各種メーカーのルミネッセンサーで測定を検討しはじめたが、遺伝子導入効率が低く、本機械での測定が困難であることが判明し、他の方法を検討していく必要があることが分かった。この検討に6か月を要したが、その間、次年度の課題の一部を実施したため、研究はおおむね順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
ChR2-TGラット（ChR2遺伝子が恒常的に神経節細胞に発現しているラット）にmGluR6プロモーターを持つAAVベクターで遺伝子導入を行い、ON型双極細胞に選択的にmVChR1を発現させる。電気生理学的に色覚の有無を確認するため、背景光に青色光を点灯させ、赤または緑色光で刺激を行うなど、背景光、刺激光の色を変化させ、視覚誘発電位を測定する。視覚誘発電位が記録された場合、オプトモーターを用いた行動学実験により色覚の有無を評価する。
これらの実験では、背景光または刺激光の光強度条件などが色覚の有無を判定するのに重要なパラメーターとなると考えられる。また、行動解析でも同様にオプトモーターの縞模様の2色間の光強度が重要なパラメーターである。これらについて慎重に検討を進め、場合によっては、電気ショックを利用したシャトルアボイダンスシステムを用いる。
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