研究課題
顎顔面領域など、上皮・間葉相互作用による転写カスケードに発生を依存する組織の発生過程には多くの転写因子と下流遺伝子が関与し、それらの異常から様々な疾患が生じる。このような疾患原因遺伝子のin vivoでの機能的意義付けには従来KOマウスによる遺伝子無効化が用いられてきたが、臨床症例で認める変異は常に機能の完全喪失には直結せず、構造―機能相関が症例毎の疾患表現型の多様性に繋がる可能性がある。本研究では、歯の発生初期に発現する疾患関連転写因子に焦点を絞り、ゲノム編集技術を駆使して、ドメイン単位での機能喪失と表現型スペクトラムとの関連を中間表現型である遺伝子発現プロファイル変化を介して詳細に解明するin vivo 分子機能アノテーションを行うことで、各遺伝子ならびに疾患病態の分子的理解を深化させるとともに、これに基づく個別化医療の実現を目的として研究を進めてきた。Msx1は歯の発生初期に重要で、古くから多数歯欠損症の原因遺伝子として知られている遺伝子であるが、その各機能ドメインもよく研究されてきた。しかし、それらは全てin vitroレベルであり、in vivoにおける解析は技術ならびに費用の問題も大きく立ちはだかっていたこともあり、全くなされてこなかったと言っても過言ではない。しかし、近年開発され、現在でも進化・発展中のゲノム編集技術により、これらの問題が大きくクリアされてこようとしている。そこで、我々はマウス受精卵を用い、in vivoレベルにおけるMsx1遺伝子各ドメインの機能解析を行ってきた。その結果、ホメオドメインより下流のMH5、MH6が歯牙形成に重要であることが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
Msx1遺伝子は、MH1N、MH1C、MH2、MH3、MH4、MH5、MH6と7つの機能領域を有すると考えられており、我々はまずホメオドメインであるMH4より下流に位置しているMH5ならびにMH6の破壊を目的とし、当該領域にgRNAを設計し、CRISPR/Casシステムをマウス受精卵に適用した。手順としては、sgRNAとCas9 mRMAをマウス受精卵にマイクロインジェクション法により導入後、仮親に卵管移植した。得られたファウンダーマウスを野生型マウスと交配させることで、様々な変異を持つヘテロ接合体が得られ、そのうち、目的の領域にフレームシフト変異をもたらすマウスを選択し、株化した。その結果、それぞれのヘテロ接合体は野生型と比較し、異なる表現型を示さなかったが、ホモ接合体に関しては以下のような表現型を示した。すなわち、MH6ホモ接合体では上顎第3臼歯、下顎第2・第3臼歯ならびに下顎切歯の欠損を示し、一部では口蓋裂も呈していた。MH5ホモ接合体では上下顎第3臼歯の欠失ならびに上顎の劣成長を示した。また、MH5とMH6の両方を欠失させたホモ接合体は、MH6欠失ホモ接合体とほぼ同様の表現型を示した。これらのことより、MH5、MH6とも歯の発生に非常に重要な機能を有していることが示唆された。
これまで、Msx1遺伝子C末端領域のMH5ならびにMH6ドメイン欠失変異体マウス作製を行ってきており、その各々において、ホメオドメインを欠失させた従来のノックアウトマウスとは異なる表現型が確認され、Msx1遺伝子のその他の領域のin vivoでの機能解析を遂行する重要性がますます示唆された。そこで、今後はホメオドメインより上流のドメイン、すなわちMH1N、MH1C、MH2、MH3の各領域の欠失変異マウスの作製を引き続き試みる。これらを行うに当たって、フレームシフト変異の結果、ホメオドメイン欠失となることを回避するよう、欠失はin-frameとなるようssODNの共導入は不可欠である。マウス作製後、表現型（歯の大きさ、歯数異常、口蓋形成）の比較をする。また、MH6ドメイン欠失を１アミノ酸ずつさらに細分することで、各アミノ酸のドメイン内での重要性を検証する。同様の手法はMH5においても遂行する。さらに、過去に報告のあるものの、疾患関連変異か多型か不明な点突然変異の検証もノックインマウスの作製を通じて検証していく。
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