| 研究課題/領域番号 |
16H05553
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
根本 英二 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (40292221)
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| 研究分担者 |
山越 康雄 鶴見大学, 歯学部, 教授 (20182470)
中村 卓史 東北大学, 歯学研究科, 准教授 (90585324)
笹野 泰之 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30196191)
金谷 聡介 東北大学, 歯学研究科, 助教 (80375097)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | Wntシグナル / 歯小嚢細胞 / 歯根膜細胞 |
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| 研究実績の概要 |
DSPは、１本の連続したポリペプチド鎖からなる前駆タンパク質（象牙質シアロリンタンパク：DSPP）として象牙芽細胞から合成され、内因性プロテアーゼにより切断され、N末端側がDSPに、C末端側は象牙質リンタンパク（DPP）となり分泌される。マウスDSPの機能ドメインを含む領域を同定するために、各ペプチド断片をコードするcDNAを完全長マウスDSPP cDNAを鋳型DNAとして用いてPCR法で増幅することを予定としていたが、本研究ではまずDSPに焦点を当てることから開始した。通法に従いマウスDSPPのN末端側のDSP遺伝子をHalo Tag発現ベクターにクローニングし、マウスDSP発現ベクターを構築した。その後、マウス歯小嚢細胞をはじめとし、その他の各種マウス由来細胞に遺伝子導入を行った。リアルタイムPCR法とウェスタンブロット法で検討したところ、目的遺伝子の発現およびその遺伝子のコードするタンパク質の発現を検出することができた。これらのDSP高発現細胞を用いて、硬組織形成細胞への分化マーカーの発現をリアルタイムPCR法で解析したところ、ある種の分化マーカーの発現が有意に増加していることが明らかとなった。さらに、レコンビナントWnt3aタンパクを用いて、その相互作用を解析したところ、前年度明らかにした基礎データ（すなわち、精製DSPタンパクとレコンビナントWnt3aタンパクの刺激において特異的な相互作用が見出されたこと）再現することができた。今後はリコンビナントDSPタンパクを用いて,これらの特異的相互作用を検証していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究ではDSPに焦点を当てることから開始し、通法に従いマウスDSPPのN末端側のDSP遺伝子をHalo Tag発現ベクターにクローニングし、マウスDSP発現ベクターを構築した。さらにマウス歯小嚢細胞をはじめとし、その他の各種マウス由来細胞に遺伝子導入を行い、リアルタイムPCR法とウェスタンブロット法により、目的遺伝子の発現およびその遺伝子のコードするタンパク質の発現を検出することができた。本年度は、DSP高発現細胞を用いて、DSPの機能的な解析を一部行ってはいるものの、当初の研究計画ではDSPの機能ドメインを含む領域を同定することが目標の一部であったことから、現在までの進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、DSP高発現細胞を用いて、DSPの機能的な解析を行ったが、次年度はリコンビナントDSPタンパクを精製し、DSPを発現していない分化度の低い細胞に作用させることで、DSPの分化誘導に与える効果を検証していく。特異的相互作用を検証していく予定である。さらに、機能ドメインを含むペプチド断片に対する発現ベクターを構築し、発現細胞に加えて、精製した各ペプチド断片を用いてDSPの機能について解析を進めていく必要がある。
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