研究課題
象牙質シアロタンパクDSPは、１本の連続したポリペプチド鎖からなる前駆タンパク質である象牙質シアロリンタンパクDSPPとして象牙芽細胞から合成され、内因性プロテアーゼにより切断されることで、N末端側がDSPとして分泌される。マウスDSP遺伝子をクローニングすることで作成したマウスDSP発現ベクターを用いて、リコンビナントDSPの生成を行った。DSP を用いた培養ヒト歯髄細胞および培養ヒト歯根膜細胞の報告では大腸菌由来リコンビナントDSPを用いていることから、グリコサミノグリカン（GAG） の存在は細胞の機能調節に必ずしも必須ではないと推測できた。そこで、大腸菌用発現ベクターを用いて6×His を付与したリコンビナント DSPタンパクを合成した。この生成したタンパクを用いて、これまでの基礎データ、すなわち精製DSPタンパクとレコンビナントWnt3aタンパクの刺激において特異的な相互作用の再現実験を行い、比較したところ、同タンパクに対する細胞の反応性が弱いことが明らかとなった。そこで哺乳類細胞用発現ベクターである、Hisタグ用およびHaloタグ用ベクターにマウスDSP遺伝子をクローニングし、構築したマウスDSP発現ベクターをHEK293 (Human Embryonic Kidney cells 293)細胞に遺伝子導入を行った。リアルタイムPCR法とウェスタンブロット法で検討したところ、目的遺伝子の発現およびその遺伝子のコードするタンパク質の発現を検出することができた。粗精製段階のタンパクを用いて実験に境したところ、細胞の分化マーカーの発現に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。
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