| 研究課題/領域番号 |
16H05908
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
堺 裕輔 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 助教 (10608904)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 肝細胞 / 内皮細胞 / 肝臓 / アレイ化 / 再生医療 |
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| 研究実績の概要 |
皮下におけるヒト肝臓の構築は、低侵襲性と高い安全性を両立した画期的な移植再生治療となり得るが、肝細胞の立体組織化と皮下生着は極めて困難である。本研究では、密に凝集させた肝細胞パターン作製技術と血管内皮細胞ネットワーク構築技術を融合させ、肝小葉構造に基づき肝細胞と内皮細胞を交互に配列・組織化したヒト肝細胞－内皮細胞索状組織（AHET）を作製することを目指している。
平成28年度に作製した多数の貫通孔を持つシリコーンフィルムをコラーゲンコーティングした温度応答性培養皿（UpCell）に貼り付け、培養器材を作製した。初代ヒト肝細胞を4.5×10^4 cells/cm^2で播種することによって、貫通孔底面に良好に接着し得た。培養3日目にシリコーンフィルムを除去した後、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を5.2×10^4 cells/cm^2で播種し、初代ヒト肝細胞－内皮細胞索状パターニングを作製した。培養6日目にヒト脂肪細胞由来幹細胞（hADSC）を3.1×10^4 cells/cm^2で播種すると、HUVECの支持細胞として機能し、HUVECが管腔様構造を形成した。温度を20℃に低下させると細胞組織体として回収することが可能で、肝細胞－内皮細胞索状組織（AHET）を作製し得た。現在、SEM及びTEMによる解析を進めている。
CRISPR-Cas9システムを利用して、Fah遺伝子のExon 9をノックアウトし、高チロシン血症Ⅰ型重度免疫不全マウス（Fah(+/-)/NSGマウス）を作出した。ジェノタイピングの結果、6種類の欠損パターンが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成29年度は、肝細胞－内皮細胞索状組織（AHET）を作製することを目指した。具体的には、平成28年度に作製したシリコーンフィルムを利用して、初代ヒト肝細胞とHUVECの索状パターニング培養が可能であった。hADSCを用いることによって、HUVECが管腔様構造を形成する特徴的な現象を確認した。また、AHETを回収することが可能であり、予定していたSEM及びTEMによる解析を進めている段階である。詳細な解析に関しては、やや遅延している。
一方、平成30年度に実施予定であった肝障害モデルマウスの作製に関して、CRISPR-Cas9システムを利用して高チロシン血症Ⅰ型重度免疫不全マウス（Fah(+/-)/NSGマウス）を既に作出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度に作製した間葉系幹細胞（ADSC）を含む肝細胞－内皮細胞索状組織（AHET）の特徴解析を行う。Live/dead染色による生存評価、免疫組織化学染色を利用したアルブミン（肝細胞）とCD31（内皮細胞）の共染色による肝細胞－内皮細胞索状構造解析を行う。ELISAやリアルタイムPCR等を利用し、尿素合成（アンモニア除去）や凝固因子産生等の肝機能、毛細胆管やトランスポーター等の肝特異的構造、HIF1Aや乳酸合成等の酸欠因子を評価する。細胞間接着、細胞極性、内皮細胞の小孔等の微小構造解析は、TEMやSEMを用いて行う。培養培地にVEGFを添加し、内皮細胞に小孔を作製する。肝小葉構造を模倣した肝細胞－内皮細胞索状構造や高い肝機能発現を有することを明らかにし、AHET作製技術を確立する。
現在、保有している高チロシン血症Ⅰ型重度免疫不全マウス（Fah(+/-)/NSGマウス）はヘテロ欠損であるため、ホモ欠損マウス（Fah(-/-)/NSGマウス）を交配により作出する。Fah(-/-)/NSGマウスは、ニチシノンの経口投与により維持する。AHETをFah(-/-)/NSGマウスの皮下に移植して生体内での拡大培養を行い、皮下肝臓の創出を目指す。形成したヒト肝組織を解析し、肝臓組織と比較する。免疫化学染色やTEM、PCR等を利用し、複雑な肝臓の構造、多岐にわたる肝機能発現、ゾーニングが再構築されているかを明らかにする。皮下での拡大培養が困難である場合、肝被膜上や腎被膜下、大網等に移植して実施する。最終的に、Fah(-/-)/NSGマウスが延命し得ることを実証する。用いる肝細胞は、初代ヒト肝細胞を軸として、初代ラット肝細胞、HepaRG細胞、iCell Hepatocytes、iCell Hepatoblats等を用い、技術の確立と最適な細胞源を明らかにする。
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