|
今年度は、項目１「DYRK1Aフォールディング中間体を標的とした化合物スクリーニング」と、項目２「ヒット化合物の構造展開」を進めた。具体的には、項目１としてin vitro翻訳・自己リン酸化カップリング系のハイスループット化を進め、自己リン酸化を特異的に認識する抗体を用いたELISAの発光検出系を構築した。これにより96-wellフォーマットでの安定な自己リン酸化の検出に成功した。加えて、DYRK1Aのリン酸化酵素活性ドメインのみを用いたin vitro精製タンパク質での評価系の構築に成功し、FINDYの活性ドメインへの作用を直接的に評価するシステムを確立した。このシステムは、二次スクリーニングとして活用した。これら二つのスクリーニングシステムを活用し、化合物スクリーニングを実施したところ、完成型DYRK1Aに対する阻害剤と構造的に類似性の高い化合物が、フォールディング中間体を特異的に阻害することを発見した。この化合物は、FINDYとは全く異なる骨格を有していることから、DYRK1Aフォールディング中間体特異的阻害の化合物側の一般性を示す結果となった。項目２として、同定した新しい阻害剤を基盤として、合成展開を行った。その類縁体には、より活性の高いものから、完成型に対する阻害活性を有するもの、活性を失ったものなど、様々な化合物が含まれていた。この構造活性相関解析と、FINDYの構造特徴を踏まえた解析により、フォールディング中間体特異的阻害剤がDYRK1Aをどのように阻害するかの特徴を示すことができた。これらの結果は、ドッキングシミュレーションと合わせて解析することで、DYRK1AのATPポケットの中のアミノ酸残基のうち、どの残基がフォールディング途中で位置の変化を起こしているかを予測することに成功した。この成果は、フォールディング中間体の構造基盤解明に資するものと期待される。
|
