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本年度は、実際に独自の共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡装置を構築し、高次横モードのベクトルビームを用いた差引イメージングを実施した。波長488 nmのレーザー光に対して、開口数1.45の油浸対物レンズで集光する条件において、反射型空間光変調器および透過型液晶素子による分割波長板を用いて多重リング状の強度分布を持つ高次径偏光・方位偏光ベクトルビームを発生し、蛍光イメージングにおける励起光として使用した。
これまでの数値計算に基づく検討結果から、ベクトルビームによる差引法では、ブライトスポットとして0次または1次の横モード次数を持つ径偏光および方位偏光を重ね合わせたベクトルビームを用い、ダークスポットに1次または2次の方位偏光ビームを用いる組み合わせが適していることが判明している。これらのビームを用いた場合、差引によって得られる点像分布関数に対して信号強度を維持しながら、負のサイドローブの発生を抑制し、本実験条件においては110 nm前後の空間分解能が期待できる。構築した顕微鏡装置において、孤立蛍光ビーズを測定試料として、これらのベクトルビームの組み合わせでの共焦点レーザー顕微鏡画像をそれぞれ取得し、画像の差引を行った。得られた差引画像からビーズ像サイズの評価を行ったところ、設計通りの強度プロファイルと空間分解能を示すことを実証した。また、固定した細胞試料に対して差引法に基づく画像取得を試み、本手法による空間分解能の向上効果を得ることに成功した。
一方で、これまでのベクトルビームを用いた差引法では、面内方向に対する空間分解能の向上効果のみを有している。深さ方向に対しても空間分解能を向上するためには、差引法に適した3次元的なダークスポットを焦点に形成する必要があり、このような観点でのベクトルビームの集光特性に対するさらなる検討の必要性も明らかになった。
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