| 研究課題/領域番号 |
16H06146
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
的場 章悟 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (20585202)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 体細胞核移植 / クローン / 初期化 / エピゲノム編集 |
|---|
| 研究実績の概要 |
体細胞核移植法では体細胞核のエピゲノムを初期化し、クローン個体を作り出すことができるが、その効率は非常に低く未完成の技術である。これまでの申請者らの研究から、クローン胚の発生異常は、ドナー体細胞に存在するヒストン修飾の一種であるH3K9me3、および核移植後のXist 遺伝子の過剰発現が大きな原因であることを示している。前年度までの研究により、上記の二つの異常原因を回避して作ったクローン胚でも、着床直後からは異常な表現型を示すことから、着床前の胚盤胞期には既にその後の発生異常の原因となるエピゲノム異常が存在することが強く示された。そこで、上記のようにして作製した胚盤胞期クローン胚のトランスクリプトームおよびエピゲノムを解析し、初期化異常の同定を試みた。WGBS法によってゲノムワイドなDNAのメチル化を解析した結果、クローン胚で特異的に起こる異常なDNAメチル化パターンを見出した。また、胚盤胞期のトランスクリプトーム解析からは、DNAメチル化依存的インプリント遺伝子も含めてほとんどの遺伝子発現が受精胚と同様である一方、最近新たに発見されたヒストン修飾（H3K27m3）依存的なインプリント遺伝子が、クローン胚ではインプリント情報を失って両アリルから発現していることを発見した。実際に、微小スケールでのChIP-seq法を用いて着床前胚でのヒストン修飾（H3K27me3）の分布をゲノムワイドに解析した結果、クローン胚ではH3K27me3によるインプリント情報が失われていることを確認した。さらに、パブリックなデータベースを用いて、様々な体細胞でのヒストン修飾を解析した結果、ドナー体細胞の時点でこのインプリント制御に関わるヒストン修飾（母方アリルでのH3K27me3）が失われていることが明らかになった。現在これらの結果を論文として投稿しているところである。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まず、計画していた通り、平成29年度は着床前のクローン胚を用いてトランスクリプトーム・エピゲノム解析（WGBS解析）を進めて、体細胞核移植による初期化異常領域・およびそのパターンを理解することに成功した。1000細胞程度の微小スケールでのヒストン修飾のChIP-seq解析にも成功し、パブリックなデータとの比較解析から、上記のようにして同定したクローン胚特有のエピゲノム異常の原因が体細胞の時点で存在することも明らかにした。これらの結果をまとめて国際誌に投稿した。
平成30年度からは、予定通り、これらの同定したエピゲノム異常に関する情報を元に、エピゲノム編集技術を用いてその修復・補正を試みる。現在は、そのためのエピゲノム編集に関わる酵素などの素材の準備を進めているところであり、準備が整い次第計画通りクローン胚でエピゲノム異常を補正するレスキュー実験に挑戦する予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
「エピゲノム編集による初期化異常の修復とその影響の解析」
平成30年度からは、これまでのゲノムワイドな解析によって見つけた初期化異常の原因となっているエピゲノム修飾の候補について、その修正・修復を試みる。まずは、DNAメチル化およびH3K27me3を対象としたグローバルなエピゲノム編集を試みる。ただし、グローバルなエピゲノム編集ではターゲット以外の領域に悪影響を与える可能性もあるため、アリル特異的なエピゲノム編集技術も検討する。CRISPR/Cas9技術を使うことで、アリル特異的なエピゲノム編集が可能であることが報告されているので、この手法を培養細胞の実験系で条件検討したうえで、クローン胚に適応する。初期化異常領域と相関するのはひとつのエピゲノム修飾とは限らないので、同時に複数の修飾を編集する可能性もある。非常にチャレンジングな実験なので、時間と労力がかかることが想定される。
次に、以上のようなエピゲノム編集実験の結果、クローン胚で認められたトランスクリプトームおよびエピゲノム異常が回復するかを確認する。これらの分子レベルでの解析と同時に、クローン胚特有の着床後の異常な表現型が回復するかについても、胚移植実験によって確認する予定である。
|
