| 研究課題/領域番号 |
16H06151
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
大学 保一 東北大学, 学際科学フロンティア研究所, 助教 (80619875)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | DNA複製 / 突然変異 / DNAポリメラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
PolζでPu-seq実験を実施するためにはPolζのポリメラーゼ活性部位を変異させrNMPを高頻度で取り込むポリメラーゼをデザインし，細胞内で発現させ，Polζによる合成をrNMPでマークする．PolζはPolε，Polδと進化的に近縁なB-familyポリメラーゼである．すでに構築したrNMPを取り込む変異Polε，Polδの配列情報をもとにPolζにおける変異すべきアミノ酸は特定した．Pu-seq実験において，この変異体を使用するためには，ＤＮＡポリメラーゼとしての機能を損なっていないことが必要条件であるので，Polζ配列上の5種類のアミノ酸置換によるＤＮＡ損傷乗越え合成反応への影響を検証しつつ，NMPを高頻度で取り込むPolζ変異体を構築した．ゲノムＤＮＡのrNMPの除去を行うRnaseH2のみが欠損した株(rnh201Δ)とrnh201ΔとPolζの二重変異株を比較した結果，二重変異株でrNMPの部位で単鎖ＤＮＡの断裂がより高頻度に起きていることが示された．これは，細胞内の変異PolζがＤＮＡポリメラーゼとして機能し，rNMPが取り込まれたことを示している．その後，リボヌクレオチド部位の切断によって得られた一本鎖ＤＮＡを抽出し，次世代シークエンサー解析のためのＤＮＡライブラリーの作成を行い，illumina Mi-seqにより網羅的な配列解析をおこなった．そのデータの解析により，ゲノム位置に沿って，Polζによる rNMPの取り込み部位を定量的に算出することに成功し，全ゲノムを網羅してPolζ機能のプロファイルを得るに至った．その結果，ＤＮＡ合成期の比較的遅れて，複製される領域において，Polζの合成が盛んに起きていることが示された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度に計画された研究には繰越期間が必要であったが，最終的に必要とするPolζ分裂酵母変異株を作成することに成功し，構築された変異株を使用して，全ゲノムを網羅してPolζ機能のプロファイルを得るに至った．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は，次年度以降の計画にある通り，ゲノムを網羅したＤＮＡポリメラーゼ機能の解析を本格化し，ゲノム上のどのような特徴がＤＮＡポリメラーゼの機能に影響に及ぼすかを直接的に検証することを試みる．加えて，分裂酵母のみならず，線虫，ヒト培養細胞の実験が進展することのより，細胞の老化，がん化に伴って起きるＤＮＡ複製機構の変化の解明に向けた重要な実験データが得らえると期待される．
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