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本年度は、本研究課題で取り組む「リボソームに翻訳履歴を付加する方法」の実現を目指し、前年度までに収集、構築した遺伝子材料を用いた研究を実施した。特に、本研究課題で翻訳反応の前後関係を検証するためのレポーター遺伝子として、出芽酵母内における選択的スプライシング機構の再構築実験に挑戦しており、前年度までに反応効率は不十分であるものの、一定の成果が出ていた。そこで本年度は、選択的スプライシング機構の反応効率の向上を研究に挑んだ。mRNA 上のスプライス領域を改変し、出芽酵母内で発現させた mRNA を逆転写して、リアルタイム PCR 法で検証する実験に取り組んだが、最終的に本研究課題で求めるレベルの十分な反応効率の達成には至らなかった。
選択的スプライシング機構の再構築実験が難航したため、代替の研究手段の検討と技術開発を並行して実施した。まず、生きた出芽酵母内で特定のタンパク質と特定の RNA との相互作用を検出する方法の開発に取り組んだ。分割タンパク質機能相補実験のうち細胞質内の相互作用の検出が可能なトリプトファン合成遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を用い、これを酵母ツーハイブリッドシステムを応用した酵母スリーハイブリッドシステムに組み込むことにより、検出感度と精度の高い実験系の構築に成功した。さらに、本研究課題では、mRNA とタンパク質の相互作用の履歴を、タンパク質の特異的な修飾によって記録する方法の開発を目指している。そのため、このアプローチとは逆の、mRNA の特異的な修飾によって記録する方法の開発にも取り組んだ。出芽酵母内で mRNA に結合するタンパク質をシチジンデアミナーゼと融合させて発現させることにより、結合対象の mRNA 中のシトシン残基をウリジン残基に変換し、この塩基置換を次世代シークエンサーを用いて解析する方法の開発に至った。
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