| 研究課題/領域番号 |
16H06185
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
宮下 脩平 東北大学, 農学研究科, 助教 (60556710)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ウイルス / 進化 / 欠失変異 |
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| 研究実績の概要 |
１、CMVのMOIの人為的制御
Nicotiana benthamianaの複数の遺伝子について、アグロインフィルトレーション法を利用してA) overexpressionおよびB) hairpin RNAの発現によるdown regulationを行い、CMV（キュウリモザイクウイルス）のMOI（細胞で複製を開始する平均ウイルスRNA数）の人為的な制御が可能かどうか検討した。具体的には、mRNAのcap構造の除去にかかわるDCP1/DCP2遺伝子のdown regulation（MOIの上昇を期待）や、CMVの増殖に寄与するeIF4EおよびeIF4G遺伝子のoverexpressionおよびdown regulation（それぞれMOIの上昇と低下を期待）を行っているが、現在のところ期待する結果は得られていない。
２、ウイルスが多数決型の意思決定システムを採用しているかどうかの実証実験
MPに欠損変異を導入したRNA3と導入していないRNA3を異なる蛍光タンパク質遺伝子で標識し、N. benthamian葉に混合接種する。最初の感染細胞で2種類のRNA3 variantは確率的な過程を経て細胞ごとに異なる比率に増幅することが期待される。この比率は細胞内の機能欠損MPと正常なMPの比率に直接的に反映されると考えられる。そこで蛍光強度の比率からこの比率を推定するとともに、各々の細胞から隣接細胞への移行の成否を観察する。これにより細胞内の欠損ゲノムの比率と細胞間移行の成否の関係を明らかにした。結果は、ウイルスが多数決型の意思決定システムを採用している可能性を支持するものであった。
３、特殊な継代条件におけるCMVゲノムへの変異蓄積
CMVをプロトプラストに継代接種した。このような特殊な条件で選択圧がかからないゲノム上の領域には、変異が蓄積することを期待した。変異の中でも特に、欠失変異についての知見は非常に少ない。そこで欠失変異の出現頻度や変異パターンを、次世代シーケンサを用いて網羅的に解析する系を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一部研究課題については期待したような結果は得られていないが、その他の課題については想定よりも早く成果が出ている。そのため課題全体としてはおおむね順調と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、昨年度に引き続きNicotiana benthamianaの複数の遺伝子について、アグロインフィルトレーション法を利用してA) overexpressionおよびB) hairpin RNAの発現によるdown regulationを行い、CMV（キュウリモザイクウイルス）のMOI（細胞で複製を開始する平均ウイルスRNA数）の人為的な制御が可能かどうか検討する。
２、タバコBY2培養細胞由来プロトプラストにCMVを継代接種して進化させることで、分節間の複製量調節機構について知見を得ることを目指す。CMVは3分節のRNAのうちRNA1とRNA2の2分節だけでプロトプラストでの複製を完結できることから、これらの2分節のRNAだけをプロトプラストに接種する。感染プロトプラストから抽出したRNAのうちRNA1またはRNA2のいずれかのみを減らす操作を行い、再びプロトプラストに接種することを繰り返す。これによりRNA1とRNA2の蓄積量比が通常とは異なる、上述の実験条件に適応した変異体が現れることが期待される。そのような変異体の配列を決定するとともに、通常の条件における適応度を野生型CMVと比較する。
３、昨年度、ウイルスが多数決型の意思決定システムを有することを実験により示した。今年度は、Nicotiana bentahamianaでのアグロインフィルトレーション法を用いた欠損型MPの発現により、ウイルスの細胞間移行が阻害されるかどうかを検討する。さらに、複数種の欠損型MPを作製してその効果を検討することで、分子メカニズムに関する知見を得る。
４、CMVをプロトプラストや葉に継代接種する。このような特殊な条件で選択圧がかからないゲノム上の領域には、変異が蓄積することが期待される。そのような変異の出現頻度や変異パターンを次世代シーケンサMiSeqを用いて解析する系を確立した。今年度はそれを利用した解析を行う。
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