| 研究課題/領域番号 |
16H06185
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
宮下 脩平 東北大学, 農学研究科, 助教 (60556710)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / 進化 / 変異 |
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| 研究実績の概要 |
１、CMVのMOIの人為的制御
昨年度に引き続き、Nicotiana benthamianaの複数の遺伝子について、アグロインフィルトレーション法を利用してoverexpressionおよびhairpin RNAの発現によるdown regulationを行い、CMV（キュウリモザイクウイルス）のMOI（細胞で複製を開始する平均ウイルスRNA数）の人為的な制御が可能かどうか検討したが、残念ながら期待する結果は得られなかった。
２、ウイルスの多数決型意思決定システムへの介入
野生型と機能欠損型の細胞間移行タンパク質(MP)が共存する場合において、CMVが多数決型の意思決定をしている可能性を昨年度明らかにした。そこで意思決定システムを人為的に阻害する可能性を検討するため、機能欠損型MP遺伝子を導入したN. benthamianaを作出する作業を行った。RNA・タンパク質発現量の確認をこれから行う必要がある。
３、欠失変異の次世代シーケンサによる解析
CMVをプロトプラストに接種した際に観察される欠失変異の出現頻度や変異パターンを、次世代シーケンサを用いて解析した結果、RNA2およびRNA3のORF内に他の領域と比べて高い頻度で欠失変異が見られることが分かった。RNA1やRNA2・RNA3の他の領域はプロトプラスト感染（単細胞感染）レベルで強い選択圧を受けているものと考えられる。外来遺伝子をRNA2に導入した場合、その領域内に欠失の片側の末端が含まれる欠失が高頻度で見られた。野生型のゲノムでは多くのシスエレメントがゲノム上に存在することで欠失変異の蓄積が抑えられている可能性が考えられる。CMVを植物葉に接種した場合、欠失変異の検出頻度がむしろ低かった。CMVなどの球形ウイルスにおいては粒子形成に適切な長さのゲノムが必要であると考えられており、この段階での選択が関与する可能性が考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MOIの人為的制御について、様々な検討を行ったが残念ながら期待通りの結果は得られなかった。また、機能欠損型MP遺伝子導入植物の作出に予定よりも時間がかかってしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、ウイルスの多数決型意思決定システムへの介入の可能性について、昨年度、機能欠損型MP発現Nicotiana bentahamianaを複数系統作出した。これらの植物は挿入された遺伝子コピー数やゲノム上の挿入位置により、異なる遺伝子発現量を持つことが期待される。今年度はこれらの複数系統の植物において、機能欠損型MP遺伝子発現量をmRNA、タンパク質の両方について比較するとともに、それぞれの植物においてCMVの意思決定システムが攪乱されて細胞間移行が阻害されるかどうか、期待通り阻害される場合はその効率について検討する。
２、欠失変異に対する選択圧について、粒子形成が関与する可能性を検討する。具体的には、粒子形成能をもたない変異体ウイルスを植物葉に接種することで粒子形成に関する選択圧がかからない状況を作り出し、この条件においてどのような欠失変異が観察されるかを調べる。また、プロトプラストを用いた実験で分節間の利害関係の調整について詳細に検討する
３、ウイルスの社会性について、その普遍性を植物ウイルス以外のウイルスや他の微生物との比較から検討を行う。
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