研究課題
植物免疫において中心的な役割を担う活性酸素生成酵素RBOHDは6 回膜貫通型の膜蛋白質であり植物からの精製が難しいが、可溶化剤などの条件検討により回収率を最大化した。さらに、タグを付加したRBOHDを自己のプロモーター及びgenomic DNAを用いてネイティブに近い状態で発現した形質転換シロイヌナズナ(pRBOHD:3xFLAG-RBOHD/rbohD)を作出した。これにより、活性のあるRBOHDを大量に(数百ナノグラムレベル)精製することに成功した。そこで、病原菌由来の免疫活性化物質であるPAMP(Pathogen-associated molecular patterns)を処理した植物、及び無処理の植物からRBOHD複合体を精製し複合体構成因子の候補を数十個同定した。これら因子をタバコベンサミアーナ植物に一過的遺伝子発現させ、PAMP誘導性の活性酸素生成へ及ぼす影響を調べた。その結果、PAMP誘導性の活性酸素生成を正、または負に制御する新規因子を複数個同定した。このうち、タバコでPAMP誘導性の活性酸素生成を負に制御した受容体型キナーゼ、及び、PB-1(Phox-Bem1 domain containing protein 1)について、シロイヌナズナ遺伝子欠損変異体を用いた解析を行ったところ、これら変異体ではPAMP誘導性活性酸素生成が亢進していた。この受容体型キナーゼに注目して機能解析を進めたところ、この受容体キナーゼは細胞膜に局在し、PAMP受容体とも複合体を形成することがわかった。また、植物の細胞内免疫受容体によるRBOHDの活性化機構について調べたところ、RBOHDのＮ末端領域の特定のアミノ酸残基がリン酸化されることを発見した。このアミノ酸残基に変異を導入すると、活性酸素の生成が完全に抑制されるとともに、病原細菌に対する抵抗性が低下した。よって、これらリン酸化は細胞内免疫受容体によるRBOHDの活性化に必須であることが明らかとなった。
1: 当初の計画以上に進展している
当初の計画の通り、RBOHDと複合体を形成しRBOHDの活性を制御する因子を複数個同定することができた。これら因子の結合解析、局在解析、及び機能解析については順調に研究が進んでいる。また、これら解析と並行して行っていた細胞内免疫受容体によるRBOHD活性化機構においても、RBOHDの活性化に必須なリン酸化部位を同定することに成功し、これらリン酸化が活性酸素生成、及び病原細菌に対する抵抗性に必須であることが分かった。このように、当初の計画以上に研究は進展している。
同定したRBOHDの新規制御因子について、シロイヌナズナ遺伝子欠損変異体、過剰発現体などを用いて機能解明するとともに、これら制御因子の植物免疫における役割について調べる。また、新規制御因子によるRBOHDの制御機構を分子レベルで解明する。４月１日より研究補助員を雇用し研究のスピードを上げていく。
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すべて 国際共同研究 (4件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 4件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件) 備考 (1件)
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