| 研究課題/領域番号 |
16H06247
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
金蔵 孝介 東京医科大学, 医学部, 講師 (10508568)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / ALS |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。昨年度LC-MSおよびgenomic screeningを行い、様々なC9orf72遺伝子産物結合タンパク質および細胞死関連遺伝子群を同定したが、細胞死関連遺伝子群については、群間のばらつきが大きく、再現性が不十分であった。そこでプロテオミックスクリーニングから得られた結合因子を元にC9orf72遺伝子の毒性に関与しうる因子を独自に作成したsiRNAライブラリーでscreeningを実行し、C9orf72変異ALSの発症に重要であるrepeat-associated non-ATG translation (RAN翻訳)の促進因子および抑制因子を同定した。特に促進因子については阻害剤を用いてRAN翻訳を抑制しうることを確認したため、今後患者由来モデル細胞およびモデル動物への投与を計画している。
C9orf72遺伝子変異を持つ患者由来皮膚線維芽細胞は米国Coriell研究所より購入し、表現系を調べているが、生育には違いがなく、また線維芽細胞のままではRAN翻訳は検出されなかったため、神経細胞へのtrans-differentiationが必要であると考えられた。C9orf72変異ALSのモデル動物としてGFP-poly-PR高発現アデノ随伴ウイルスおよびC9orf72の(GGGGCC)配列高発現アデノ随伴ウイルスを作成し、精製を行った。これらのウイルスを脳室内に投与したモデルマウスを作成したが、発現量が低く神経変性等明らかな表現系を得られなかったため、Jackson laboratoryよりC9orf72遺伝子トランスジェニックマウスを購入し、screeningで得られた化合物のin vivoでの作用を確認する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。我々がプロテオミックスクリーニングの結果を元に施行した遺伝子スクリーニングによりC9orf72遺伝子変異によるRAN翻訳に関与する遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群のうち、数種の遺伝子については同じ細胞内シグナル経路を担う分子であったため、このシグナル経路に対する阻害剤および遺伝子のノックダウンを行った結果、RAN翻訳が抑制されることを細胞株で確認した。本化合物については新規ALS治療薬シードとなりうると考えている。これらの化合物の作用を患者由来細胞および動物モデルで確認するため、C9orf72変異ALS患者由来皮膚線維芽細胞を購入し、現在表現系を評価しているが線維芽細胞では明らかな表現系を持たなかったため、神経系への分化を行っている。また化合物の効果をin vivoで確認するため、アデノ随伴ウイルス投与による動物モデルの作成を行っている。現在のところ明らかな表現は出ていないため、Jackson laboratoryよりC9orf72トランスジェニックマウスを導入を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。我々は本年度治療薬シードとなりうる化合物を同定しており、細胞での効果を確認した。今後これらの化合物についてはC9orf72トランスジェニックマウスへの投与およびC9orf72変異ALS患者由来神経細胞への投与を行い、治療効果を判定する。患者由来神経細胞の作成についてはinduced Neuronと呼ばれるtransdifferentiationを行う予定である。我々はすでにRAN翻訳産物に対する抗体を樹立しているため、治療効果の指標としてはRAN翻訳産物の抑制の程度を免疫染色およびウエスタンブロット法により確認する他、神経機能、神経細胞死について評価を行う。また、RAN翻訳産物であるpoly-PRの毒性機構を分子レベルで明らかにするため、生化学的実験を進めてさらなる創薬標的を探索する予定である。
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