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本研究課題は、①セメント芽細胞のマーカー遺伝子を同定し、同細胞の分化誘導条件を決定するとともに、master regulatorを探索する、②セメント芽細胞特異的Cre driverマウスを作製し、細胞系譜解析によりセメント質の恒常性維持および組織損傷時の再生機構を明らかにすることにより、cementogenesisを正しく理解し、新規歯周組織再生治療法の開発につながる基盤情報を得ることを目的としている。本年度は主に以下の3つの成果を得た。
1.歯根膜細胞のセメント芽細胞へのcommitmentを制御する因子を探索するため、①マウス歯根膜組織由来細胞の初代培養プロトコルを確立し、②得られた細胞集団をシングルセルソート法にてクローン化した上で、③石灰化誘導培地で培養した際に石灰化ノジュールを形成しやすいクローンと形成しにくいクローンを選別し、④両者の遺伝子発現についてRNA-seq法で検討したところ、石灰化能が高いクローンで有意に発現が増加している遺伝子82個を見出した。
2.樹立した歯根膜細胞クローンにおいて、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により上記の遺伝子群をノックアウトし、再度シングルセルソート法を用いてクローン化することで遺伝子機能の解析を行った。さらにRNAscope HD 2.5システムを用いて、歯周組織における発現局在を検討した。
3.新規ノックインマウスのターゲティングベクターの作製、ES細胞への導入および、PCRおよびサザンブロットによる相同組換えES細胞の選別が完了した。
以上の得られた結果を取りまとめ、国内学会で発表を行った。
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