| 研究課題/領域番号 |
16H06290
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
伊藤 幸成 国立研究開発法人理化学研究所, 伊藤細胞制御化学研究室, 主任研究員 (80168385)
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| 研究分担者 |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (20423973)
松尾 一郎 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40342852)
梶原 康宏 大阪大学, 理学研究科, 教授 (50275020)
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
戸谷 希一郎 成蹊大学, 理工学部, 准教授 (80360593)
平林 義雄 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, チームリーダー (90106435)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-26 – 2021-03-31
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| キーワード | 小胞体 / 糖タンパク質 / 糖脂質 |
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| 研究実績の概要 |
・小胞体内糖タンパク質品質管理機構に関与するシャペロンへの抗体存在下で、化学合成した糖タンパク質のフォールディングを追跡した。その結果、糖鎖の有無によってリフォールディングシステムが使い分けられていることが確認できた。糖タンパク質の品質管理機構におけるSep15の関与を解析するために、ヒトUGGTのトランケート組み換えタンパク質を調製し結合部位を探った。合成基質を用い、小胞体画分内におけるグルコースの切断および転移に関するアグリコン特異性を解析し、タンパク質部分のフォールディング状態によって調節される可能性が示唆された。また、小胞体存在する２つのマンノース切断経路を解析する上で端緒を開く結果を得た。
・カルレティキュリンのラット小胞体におけるmRNA発現量／タンパク質発現量／活性を比較解析し、疾患との連動を明らかにした。
・新規な糖鎖合成反応と糖タンパク質の合成の基盤技術について検討した。加えて、加水分解酵素Endo α-mannosidaseがオリゴ糖の合成に応用できることを明らかにした。318残基からなる糖鎖型付加シアル酸転移酵素の半合成に成功した。
・小胞体の糖脂質PtdGlc およびChoGlcに着目して研究を行った。PtdGlc生合成酵素がUGGTであることを証明するためにノックアウトマウス由来のMEF細胞を調整した。PtdGlc のリゾ体（LPGlc）の特異な生物活性に着目し、多様性志向型合成に対応できるアナログをデザインし、その合成ルートを開拓した。グルコシルセラミド分解酵素とCholGlcの合成を関連づけた。
・C-Man化糖修飾の小胞体タンパク質品質管理における意義を明らかにするため、Mindinの野生型とその非C-Man化型遺伝子を発現させ、双方のタンパク質生合成や分泌について解析した。その結果、C-Man化糖修飾のタンパク質分泌への関与が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、当研究組織が有する要素技術の課題への適用性を検証することに主眼を置いた。以下に記載するように、29年度以降の研究における指針となる成果が得られ、研究の基盤が固められたと考えている。
これまで理解が不十分な糖タンパク質の選別過程（分泌経路／分解経路）について、本経路の調節分子を見出した。また、小胞体画分内で糖鎖プロセシングがアグリコンの状態を反映して制御されている現象を見出した。これらの成果から、選別経路の解明に関しては、順調に進捗しているものと考えている。また糖タンパク質品質管理と疾患の関わりを明らかにしたことから、医療応用に関する先鞭をつけたものと考えている。
小胞体内糖タンパク質フォールディング系の解析を進め、糖鎖・糖タンパク質基質に対する認識機構を分子レベルで解析するために、これまでに大量に調製できることが明らかになっている麹菌由来UGGTの活性中心を含むC末端側ドメインの大腸菌組み換えタンパク質を調製する系を確立した。また、必要な糖タンパク質の合成を行うとともに、糖誘導体や新規酵素反応が見出された。特に、糖転移活性を持つ酵素の半合成に成功したことは、その先進性を示すものである。
一方、UGGT1,2のノックアウトマウスから調整したMEF細胞を使うことにより、PtdGlc合成に両者の転移酵素が関与していること、その発現がERストレスに応答している可能性を示された。加えて、新たな発想でLPGlcのアナログを合成する戦略を開発し、次年度以降の指針を固めることができた。
C-Man化糖修飾の機能を調べるため、Mindinに着目した実験系を整えた。細胞内のMindinの小胞体における生合成の解析が可能になったことから、研究の基盤準備は整ったと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
問題点の解決に向けて以下の方策をもとに研究を総合的に推進し、大きな成果につなげたい。
引き続き「UGGTの基質認識機構の解明」、「Sep15の品質管理機構における役割の解析」、「EDEMsのマンノシダーゼ活性の有無の検討」を中心に研究を進めるが、懸念は組み換えEDEMタンパク質は調製できたものの、人工基質に対するマンノシダーゼ活性が見いだせていないことである。様々な疑似ミスフォールド糖タンパク質基質を中心に解析を進めたい。化学合成したM９型糖ペプチドを小胞体画分内でリフォールディングさせる際のグルコース付加量とリフォールディング効率の関係を様々な修飾糖ペプチドを用いて追跡する。ミスフォールド糖タンパク質の結晶化を検討する。
本年度見出された新規な糖鎖合成反応を積極的に利用して、小胞体や細胞質関連の糖鎖を合成する。得られたオリゴ糖に蛍光標識などを施すことで、酵素活性測定が可能なプローブ合成へと展開する。
PtdGlcは量的に極めて微量で、かつ主成分の脂質と物理化学的な性質が類似しているため、質量分析計による検出が可能となったので、細胞より精製したER膜での生合成活性を検討する。また、ERストレスとグルコース化脂質の関連を調べる。蛍光標識化ホスファチジン酸を用いた簡便で高感度な測定系の確立を目指す。
LPGlc類縁体の系統的な合成を進めるうえで、溶解性の問題が予想される。それを回避するために、合成と精製に関して汎用性の高いプロトコールを確立する必要がある。
C-Man化糖修飾のタンパク質品質管理における機能的役割を明らかにする必要がある。そのために、Mindinを用いる実験系を発展させ、酸化還元制御の関与を中心に解析する。また、C-Man転移酵素と考えられるDPY-19L1/3遺伝子の発現制御とMindinの生合成や小胞体品質管理機構への影響について解析を進める。
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